2 × Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)
1 h轻松扩增10 kb以内片段，让您的实验更高效！
分子克隆；基因鉴定；高AT/GC体系
快速扩增：1h即可完成10kb以内片段的扩增
保真度高：保真度是 Taq DNA Polymerase 的106倍
高成功率：轻松扩出目的条带
适应性广：可兼容粗品模板、高GC/AT模板(整体GC 24%-79%，局部22%-88%)、甲基化模板、含PCR抑制物模板
操作便捷：加入引物和模板即可进行扩增，产物含蓝色Loading Buffer，可直接电泳检测
1.快速扩增
使用2 × Phanta Flash Master Mix（Vazyme #P510，简称P510）和2 × Phanta Flash Master Mix (Dye Plus)（Vazyme #P520，简称P520）以及其他高保真酶（TB1、TB2），采用1 sec/kb的延伸速度扩增353 bp、873 bp的目的片段，采用4 sec/kb和5 sec/kb的延伸速度扩增7,140 bp的目的片段。结果显示，P510和P520均可成功扩增。
2.高保真度
采用二代测序方法（P. Mielinis. et al. Journal of Molecular Biology (2021)），测定不同聚合酶的扩增保真度。结果显示，Phanta Flash Super-Fidelity DNA Polymerase保真度是Taq DNA Polymerase的106倍。
、
3.高特异性
使用P510、P520和市售其他品牌高保真酶，按照各自说明书推荐体系和程序扩增不同长度片段，结果显示，P510和P520与其他品牌高保真酶相比，扩增特异性更高。
本产品延伸快速(≤10 kb片段，5 sec/kb;>10 kb片段，10 sec/kb)，保真度是Tag酶的106倍。通过缓冲优化，扩增特异性与模板适应性进一步提高。使用方便，只需加入模板和引物即可进行扩增；并且含电泳指示剂，PCR反应完成后无需额外添加loading buffer，可直接点样进行电泳。
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组分 |
P520-01 |
P520-02 |
P520-03 |
|---|---|---|---|
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2 × Phanta Flash Master Mix(Dye Plus) |
1 ml |
5×1 ml |
15×1 ml |
-30 ~ -15℃保存
Q1：扩增效率低，实验组无扩增条带。
A1：(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解；引物设计是否合理，可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开，此时加入PCR Enhancer（货号P021），可以有效降低解链温度；模板为粗品，存在抑制物，建议降低模板浓度（稀释使用；若样本为植物叶片，要确保植物为非多糖多酚植物，取新鲜幼嫩的叶片，并将叶片面积剪小，如黄枪头尖部面积大小）；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 酶
反应所用的酶失活，建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误，建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实际温度是否相符，如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活，温度过低则模板变性不彻底；若模板为酵母菌，可将预变性时间延长10min；退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度；如果目的片段较长，可尝试Touch Down 程序；检查延伸时间是否充足。
Q2：扩增的条带亮度不太亮。
A2：(1) 引物
检查人工合成的引物是否降解。
(2) 模板
首先确认模板的质量，长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；如果模板没有了，可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。
(3) 反应程序
可尝试使用Touch Down程序；延长延伸时间，提高循环数。
Q3：扩增特异性差，非特异性扩增。
A3：(1) 引物
引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。
(2) 模板
模板不纯，被污染，需重新制备模板。
模板降解或过量，通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。
(3) 反应程序
反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
Q4：扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。
A4：(1) 胶
制胶时要使胶完全融化。
(2) 引物
检查引物是否降解。
(3) 模板
模板降解或过量，可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长，模板是cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度，逆转录时不加随机引物重新逆转录。
(4) 反应程序
反应程序不够优化。退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度；尝试Touch Down 程序。
Q5：空白对照出现扩增产物。
A5：(1) 引物设计不合理
扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致，说明有污染
更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染，可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
Q6：高保真酶扩增保真性差，存在突变。
A6：高保真酶在PCR时扩增产物有突变，可以从以下几点来分析：
(1) 模板本身存在突变
检查模板，若模板是质粒，建议送质粒去测序；若模板是cDNA，建议重复实验，如果仍有突变，可能是cDNA有问题，建议重新制备cDNA，制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。
(2) 模板长时间在紫外光下照射，引入突变
切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。
(3) 基因序列与NCBI上的不一致
建议再重复一次送去测序，若结果和上一次一样，说明序列可能和NCBI上的不一致。
(4) 少量序列存在非严谨序列
有相似重组序列，导致重组错位。
Q7：逆转录后的产物cDNA作为模板，使用高保真酶，一次应该加多少体积？
A7：说明书建议cDNA模板使用量为1-5μl（不超过PCR反应总体积的1/10），可在这个范围内尝试不同的使用量，摸索合适使用量。
Q8：带颜色的PCR产物(p520,p525扩增产物)是否影响酶切效果？
A8：经测试，带颜色的PCR产物不会影响酶切效果。
Q9：高保真酶扩增产物是否带A尾，如何加A尾
A9：（1）高保真酶扩增产物不带A，后续做克隆可尝试使用Vazyme无缝克隆产品C601；若进行TA克隆可用普通的Taq酶进行加A尾；
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