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论文 | Nature！清华大学颉伟团队发现生命起源的关键调控因子
在合子基因组激活( Zygotic Genome Activation，ZGA)过程中，卵子必须失去自己的身份，使基因控制从母体转移至胚胎。为了实现这种转变，需要重置和唤醒——胚胎中的一些“先锋”基因发生转录并翻译成蛋白质，并作为调控因子激活基因组中其它基因，通过级联放大建立复杂而有序的调控网络，新的生命由此开始。首批主调控基因是哪些？它们是如何调控细胞发育的？清华大学颉伟团队发现OBOX家族是调控小鼠合子基因组激活的关键转录因子，为哺乳动物合子基因组领域研究提供了新的研究方向，是该领域里的重要突破。 研究内容 通过大量的筛选和分析，研究者发现OBOX对小鼠胚胎发育有着关键作用，敲除Obox的小鼠胚胎发育出现了严重缺陷，ZGA过程也受到重创，系统恢复OBOX后一小部分胚胎可以正常发育至胚泡（图1），研究者使用Stacc-seq技术验证了自己的猜想——OBOX 优先富集在增强子、启动子、MERVL和B1/B2/B4重复元件上，优先结合并调节具有OBOX基序的ZGA基因。因此，研究者确认OBOX家族调节小鼠胚胎中的次要和主要ZGA，并将目标锁定在了OBOX家族中。 图1. OBOX对小鼠胚胎发育的影响 RNA聚合酶Pol II行使着将DNA转录为RNA的功能，但它本身是一种哑酶（Dumb Enzyme），需要转录因子的引导才能发挥功能，从而使转录总是发生在正确的时间和地点。通过Stacc-seq技术，在E2C胚胎中的OBOX1和OBOX5结合先于Pol II募集，增加了OBOX将Pol II引导到这些靶点的可能性（图2），RNA Pol II定位到正确的基因，从而激活合子基因组。 图2. 不同时期小鼠胚胎Pol II、OBOX结合情况和染色质开放程度 由此，研究者开始思考，既然OBOX可以促进基因转录，那么它是否会影响染色质开放性呢？通过ATAC技术，研究者发现在Obox mzKO L2C胚胎中，约21%的活性增强子显示染色质可及性显著降低，未能打开启动子和增强子也与附近ZGA216基因的下调有关。因此，OBOX的缺失降低了L2C特异性Pol II结合位点的染色质可及性（图3）。 图3. OBOX对Pol II预配置和染色质可及性的影响 关键技术 在该研究中，清华大学生命科学学院颉伟课题组与诺唯赞合作，在CUT&Tag试剂盒Vazyme #TD901的基础上进行了定向优化，开发了高灵敏度方法来检测蛋白和DNA在全基因组相互作用——Stacc-seq，该技术可以在超低数量的细胞中检测到目的蛋白全基因组范围的结合图谱，从而对小鼠胚胎早期发育过程中的基因组激活有了关键了解。 OBOX家族是既TPRX之后颉伟团队发现的第二个小鼠ZGA关键调控因子，部分通过促进Pol II预配置和CG缺乏的启动子和增强子处染色质优先开放。此研究进一步完善了哺乳动物ZGA调控机制，揭示了生命开始的奥秘。 除此之外，某个OBOX家族成员能否执行特定职能还有待进一步探索，更多参与ZGA调节的转录因子还等待被发现！
技术创新丨诺唯赞Dimer Free技术突破NGS行业难题
2024-02-18
高通量测序文库构建时，你是不是也常常碰到这种情况：文库峰型图中目标文库前面出现非特异性片段，呈尖刺状，这就是二聚体，主要是由接头或引物自连所形成。 图1. 含二聚体的文库示意图 二聚体的存在会对实验结果造成较为严重的影响，一直是行业内亟待解决的难题。 二聚体的存在会导致以下问题： 1. 操作体验繁琐 在湿实验阶段需要针对不同投入量调整接头用量； 2. 影响数据质量 干扰文库真实产出的测定，导致有效下机数据量不足，数据质量差，难以满足后续分析需求； 3. 增加测序成本 严重时需加测数据量，造成时间和人力成本相应增加。 我们深深理解面对以上问题时的痛苦，因此，诺唯赞研发团队坚持不懈地研究，寻求创新的突破。经过无数次的试验和改进，最终开发出了Dimer Free技术（简称：DF技术），能够从根本上降低二聚体残留，提升数据质量，并统一接头用量，优化操作体验。为更准确和更便捷的建库实验保驾护航。 Dimer Free技术原理介绍 DF- Dimer Sniper消除原理 经研究发现，T4 DNA连接酶不仅可以对接头和模板进行连接（TA连接），同时也能够对其他不匹配的碱基进行连接（接头之间的TT连接）。在建库过程中形成的小片段二聚体，就是由于这种非特异性连接形成的错配产物，见下图2。 图2. T4 连接酶连接示意图 针对这一碱基错配特征，诺唯赞研发团队进行了深入研究和多次试验，最终从原核生物中发现了一种能够识别碱基错配的限制性内切酶，并以此为基础，通过蛋白质功能改造平台，运用理性设计和定向进化技术，进一步提升了该内切酶的识别特异性和切割活性，最终成功研发出一款高效的内切酶，命名为Dimer Sniper。该内切酶能够特异性地对T-T错配碱基进行切割，从而有效地消除接头二聚体。 图3. DF- Dimer Sniper消除原理 DF- Flowsizer筛选原理 除接头二聚体之外，在文库扩增过程中也会形成引物二聚体，这些二聚体的长度比正常文库偏小。基于这一特点以及对纯化过程的深入理解，诺唯赞研发团队开发出一款专门去除小片段的洗脱试剂，命名为Flowsizer。其原理类似于分子筛，可以根据片段大小的差异进行筛选，如下图4所示。在文库的回收过程中添加，可以特异性的对接头和引物二聚体进行去除，大幅提升目标文库比例。 图4. DF- Flowsizer筛选原理 测试数据展示 接头二聚清除效果测试： 对含有不同比例接头二聚体的文库进行测试，接头二聚体的去除效率均高达80%以上（最高可至100%）。 图5. 接头二聚体去除效果图 引物二聚清除效果测试： 在多重扩增建库中，文库纯化阶段使用DF技术可以显著降低引物二聚体的比例（高达90%以上），实现有效靶标的高效富集，提升测序的有效数据产出和靶标检出率。 图6. 引物二聚体去除效果图 统一稀释倍数，优化操作流程： 在以往的建库实验中，针对核酸投入量的不同，需要对接头进行不同比例的稀释，以减少二聚体的产生。现在，得益于DF技术的成功研发，可以真正做到“兼容”不同模板投入量，无需调整接头稀释比例，如图7所示。在提升操作体验的同时，也意味着在低模板投入量的场景下，可以通过增加接头用量来进一步提高文库转化率。 图7. 二聚体去除效果图 诺唯赞将对多系列产品统一引入二聚体清除技术，优化操作体验，全面改善测序结果，助力您的实验提质增效，敬请期待！
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