病毒RNA基因组遗传信息分析；病毒RNA建库
· 操作简便：采用两轮 PCR 方法，全流程低至 5 h
· 优异的覆盖度：定制的 Panel 对病毒全基因组的覆盖度达到 99.7%
VAHTS RNA Multi-PCR Library Prep Kit是基于多重扩增建库原理，用于测序分析病毒RNA基因组遗传信息的试剂盒。本试剂盒包含完整逆转录模块和多重PCR扩增建库模块，其中文库构建采用两轮PCR方法，完成基因组靶向扩增及富集。从获得病毒基因组样本到完整上机文库全流程耗时低至5 h，其中手动操作时间小于1.5 h。本产品兼容起始模板范围16 - 38 CT，构建好的文库适用于Illumina高通量测序平台进行测序分析。
本试剂盒定制的Panel对病毒全基因组的覆盖度达到99.7%，能够有效地用于检测出基因组突变及缺失位点。本试剂盒的优化组合使结果更加稳定、可靠，帮助研究者和检测人员简便、快速、高质量地完成病毒RNA建库。试剂盒中提供的所有试剂均经过了严格的质量控制和功能验证，较大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
1. 广泛的样本投入量
以不同拷贝数的病毒 RNA 为起始模板，参照 NA211、A、B、C公司同类产品的建库流程进行文库构建，使用 Qubit 检测文库浓度。
图1. 不同投入量下的文库产量
在不同模板投入量下（病毒 RNA 的 CT 值分别为 20.6、23.8、26.7、30.4、34.2、38.1），NA211 均能高效建库。
2. 优异的覆盖度
以不同拷贝数的病毒 RNA 为起始模板，参照 NA211、A、C公司同类产品的建库流程进行文库构建，PE150 测序，测序数据量10 M Clean reads 进行分析。
图2. 不同投入量下的文库覆盖度
在不同模板投入量下，NA211表现出优异的病毒全基因组的覆盖度。CT=16-30，测序覆盖度>99%；CT=30-32，测序覆盖度>98%；CT=32-38，样本可检出。
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
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1. 文库产量偏低
① 重新定量投入模板量，确认模板起始量是否正确。若低于下限(RNA浓度阈值大于38 CT)，需提高投入模板量(建议最佳RNA拷贝数区间为20 - 35 CT)。
② 若模板质量较差，可适当提高循环数或使用高质量模板。
③ 请确认每一步体系以及程序是否按照说明书进行，并注意每一步骤中各项操作细节。
④ 文库纯化磁珠干燥环节，不能时间过长导致磁珠过于干燥，过于干燥也会降低产量。
⑤ 进行文库扩增时，需确保无磁珠残留，否则可能抑制扩增反应。
⑥ qPCR文库定量时，请确保循环时间以及循环数正确。
2. 接头二聚体较高
① 当投入中低浓度模板时(CT = 30 - 38)，因为可捕获的模板较低，多重扩增引物、接头引物之间不可避免地产生二聚体，按照推荐数据量的两倍进行测序。
② 当投入中低浓度模板时(CT = 30 - 38)，在不影响覆盖度的前提下，可以将第二轮扩增引物体积减半投入，或者降低第二轮扩增的循环数，能够有效地减少引物/接头二聚体。
③ 本产品所建文库主峰与引物/接头二聚体存在约200 bp的间隔，峰形特异且不连续。单纯的引物/接头二聚体可以通过生信手段过滤掉，并不影响测序的覆盖度。
3. 文库均一性较差
① 多重扩增循环数可适当降低。
② 模板拷贝数偏多，可适当降低至20 - 35 CT范围内。
4. 为什么需要分区操作
① PCR产物极易产生气溶胶污染，进而导致实验结果不准确、可信度不高等问题。因此，我们推荐您将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化区进行强制性的物理隔离，使用专用的移液器等设备，并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理)， 以保证实验结果的可信度。
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