Ribo-off rRNA Depletion Kit V2 (Bacteria)
升级版革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的rRNA去除
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌总RNA的rRNA去除；mRNA和非编码RNA分析
· 快速与实力并存：优化体系，保证rRNA去除效率的同时流程上缩短至1h
· 适用范围广：物种覆盖度提升，适用物种更广泛。
Ribo-off rRNA Depletion Kit V2 (Bacteria) 是针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌总RNA中去除rRNA的试剂盒。总RNA样本经过rRNA与探针杂交、RNase H消化、DNase I消化等步骤，将rRNA(包括16S和23S rRNA)从总RNA中去除，保留mRNA以及其它非编码RNA；该试剂盒同时适用于完整的和部分降解的RNA样本 (例如FFPE RNA)，得到的RNA可用于mRNA和非编码RNA (例如IncRNA)分析。
1. 不同起始量模板
以枯草芽孢杆菌为起始模板，投入量为1 μg/100 ng/10ng，分别进行不去除和使用Vazyme #N417、Vazyme #N407、A公司和B公司同类产品进行rRNA去除，随后均使用VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina(Vazyme #NR605)进行转录组文库构建。通过对高质量的Clean Reads进行分析。结果显示在不同投入量下，Vazyme #N417去除rRNA效率均优于N407及其他品牌试剂，并在10 ng低投入量下优势尤为显著。
图1. 不同起始量下rRNA去除情况
2. 物种兼容性测试
解淀粉芽孢杆菌、格式芽孢杆菌、变异链球菌等使用Vazyme #N417进行rRNA去除，随后均使用Vazyme #NR605进行转录组文库构建。通过对高质量的Clean Reads进行分析。结果显示：Vazyme #N417可兼容多物种的rRNA去除。
图2. 不同物种使用Vazyme #N417的rRNA去除情况
3. 复杂样本兼容性测试
以土壤提取RNA为测试样本为起始模板，分别进行不去除和使用Vazyme #N417、Vazyme #N407、A公司和B公司同类产品进行rRNA去除；使用Vazyme #NR605进行转录组文库构建，通过对得到高质量的Clean Reads进行分析。结果显示：Vazyme #N417 的rRNA残留率明显低于Vazyme #N407、A及B公司品牌，并且在已检出菌种上，rRNA残留率多低于其他品牌，说明Vazyme #N417能够覆盖更多菌种的rRNA去除。
*使用Silva数据库进行rRNA 残留分析，对于top 10 菌种的 rRNA残留率进行展示。
表1. 土壤样本的rRNA残留情况
4. 基因检出率
Vazyme #N417搭配使用VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina(Vazyme #NR605)中的进行转录组文库构建。在基因检出数指标上，与Vazyme #N407和B同类产品一致，优于A同类产品，保证了丰富的基因检出数。
图3. 各品牌产品基因检测数
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
Q1.纯化产物可以如何保存？
纯化产物由于浓度较低容易降解，去除rRNA的样品应尽快进行下游实验，否则于-80 ~ -65℃保存。
Q2.如果纯化产物用于文库构建，但是使用的是Nuclease-free ddH2O洗脱，如何操作?
使用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illunima (Vazyme #NR604)时，若条件允许，加入等体积的VAHTS 2 × Frag/Prime Buffer (Vazyme #N402)，之后反应体系均放大，直至做到纯化步骤，恢复体系；也可以再次使用VAHTS RNA Clean Beads (Vazyme #N412) 进行纯化，最后用Frag/Prime Buffer洗脱。
Q3.如果纯化产物用于文库构建，打断条件和扩增循环数怎么选择?
使用VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for lllumina (Vazyme #NR605)进行文库构建时：打断条件建议为86℃，5 min，按照16 μl/7.5 μl分选，获得主峰为350 - 450 bp的文库。扩增循环数建议如下：
Q4.如果起始文库浓度过低，可以从哪些角度去寻找原因并如何改进？
rRNA去除后RNA的产量取决于起始RNA的质量、样品中rRNA的含量及使用的纯化方法。以高质量的RNA样品为模板构建得到的文库浓度均能达到上机测序要求，如果无法提取合格的RNA样品，可以尝试使用以下方法弥补：
① 起始量：提高样品起始量，上限1 μg；
② 做几个重复的样品，纯化步骤后合并在一起；
③ 做不分选方案：94℃，8 min打断条件下RNA片段虽然偏小，但是分布会集中，均一性也较好。
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