BioSmart MethyLight DNA Polymerase
甲基化检测专用的探针法qPCR试剂
肿瘤甲基化、肿瘤早筛
- 甲基化qPCR专用试剂：适用于亚硫酸盐转化DNA模板甲基化qPCR检测，耐亚硫酸盐、耐U，具有较高的成功率
- GC兼容性广：能够广泛兼容 GC 含量范围为 20%~75%的各类体系
- 样本适应性好：适用于粪便提取物、脱落细胞、血液、肺泡灌洗液、质粒等常见样本提取转化产物，用于多癌种检测
- 荧光值高：更高的荧光平台值，扩增线型更优
- 灵活度高：关键组分分装，可根据需求，灵活调整体系
BioSmart MethyLight DNA Polymerase使用BioSmart平台，系统地对酶的亚硫酸盐耐受性，不同样本提取转化产物的适用性，GC含量的兼容性，耐尿嘧啶以及3'端错配碱基识别能力进行筛选，显著提升了DNA甲基化应用场景下多重靶标的灵敏度、特异性、低拷贝检出率，可得到重复性好，扩增线型优异，靶基因定量和检测准确的结果。本产品是酶和Buffer拆分的形式，可根据体系的差异性灵活的调节酶、Mg2+和dNTP的浓度。
1. 甲基化qPCR专用预混液：
适用于亚硫酸盐转化DNA模板甲基化qPCR检测，具有优越的扩增线型，更高的荧光平台值。
图1.不同试剂扩增亚硫酸转化后的DNA比对
2. GC兼容性广：
甲基化检测的CpG岛区域，在甲基化转化后存在GC含量跨度大，因此需要一款可同时兼容高低GC的qPCR试剂。Vazyme #EM701能够广泛兼容 GC 含量范围为 20%~75%的各类体系，减少由于扩增偏好性对检测结果的影响。
图2.不同GC含量的甲基化模板的扩增情况比对
红色：Vazyme #EM710，蓝色：Supplier D
3.良好的样本适应性：
对于常见癌种检测的样本均具有良好的样本适应性，如：粪便提取物、脱落细胞、血液、肺泡灌洗液、等常见样本提取转化产物；可用于多癌种的检测。
图3.Vazyme #EM710在不同样本中的扩增情况
红色：Vazyme #EM710，绿色：Supplier D
|
组分 |
EM710-01 |
EM710-02 |
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5 × BioSmart MethyLight Buffer (Mg2+ free) |
800 μl |
200 μl |
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dNTP Mix (10 mM each) |
100 μl |
250 μl |
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BioSmart MethyLight DNA Polymerase (5 U/μl) |
80 μl |
200 μl |
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MgCl2 (100 mM) |
200 μl |
500 μl |
a. 包含dNTP Mix，Mg2+，BioSmart MethyLight DNA Polymerase等。
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
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◇ 扩增曲线形状异常
① 扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生；提高模板浓度重复实验。
② 扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值 - 4)，重新分析数据。
③ 个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
◇ 反应结束无扩增曲线出现
① 反应循环数不够：一般设置循环数为45，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
② 确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃
延伸阶段。
③ 确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
④ 模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从原浓度做起。
⑤ 模板降解：重新制备模板，重复实验。
◇ CT值出现太晚
① 扩增效率偏低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。
② 模板浓度太低：降低稀释倍数重复实验，一般未知浓度的样品先从原浓度做起。
③ 模板降解：重新制备模板，重复实验。
④ PCR产物太长：推荐PCR产物长度为80 - 150 bp。
⑤ 体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，提高模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
◇ 阴性对照出现明显扩增
① 反应体系污染：更换新的Mix、ddH2O、引物、探针重复实验。
◇ 绝对定量时标准曲线线性关系不佳
① 加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。
② 标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
③ 模板浓度太高：提高模板稀释倍数。
◇ 实验重复性差
① 加样体积失准：使用性能较好的移液枪；提高模板稀释倍数，提高加样体积。
② 定量PCR仪温度控制孔间差异大：定期校准仪器。
③ 模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
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