Dual Luciferase Reporter Assay Kit
双萤光检测、结果更可靠
检测基因调控作用
· 萤光信号强: 用于弱启动子或低水平表达调控的检测
· 检测范围宽: 线性范围达 8 个数量级(R²>0.99)
· 灵敏度高: 检测灵敏度低至10-18 mol
分别构建Firefly luciferase 表达载体及Renilla luciferase 表达载体，共同转染HEK293T 细胞。使用不同公司试剂盒裂解细胞并检测Luciferin 及Coelenterazine 萤光强度。结果显示： Vazyme 的双萤光素酶检测试剂盒中两种底物的萤光强度与P 公司一致，均显著高于T/B/Y 公司同款产品。
使用10-11~10-18 mol Luciferase（Sigma# L9506) 作为检测底物，使用V的1*细胞裂解液溶解后梯度稀释到10-11~10-18 mol 并检测Luciferin荧光强度。线性关系达到8个数量级（R2>0.99），检测下限达到10-18 mol/assay。
Dual Luciferase Reporter Assay Kit 用于检测报告质粒转染细胞后Luciferin 底物萤光强度，从而反映萤光素酶的表达量，达到检测基因调控的目的。首先以萤光素（Luciferin）为底物检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)，后以腔肠素为底物检测海肾萤光素酶（Renilla luciferase), 实现双萤光素酶报告基因检测。双萤光素酶检测试剂盒通过检测萤火虫萤光素酶活性，评价调控元件受刺激物诱导的作用强弱；Renilla luciferase 作为校正转染效率的内参，消除孔间细胞数量和转染效率的差异， 确保结果可靠。
-20℃保存；溶解分装后的Luciferase Substrate 可于-80℃长期保存，或-20℃短期保存不超过1个月
Q1：双萤光素酶操作注意事项
A1：（1）先设置酶标仪程序，到放入酶标板就可以测定的程度，再开始加样。程序设置选择“化学发光/luminscence/LUM/全波长，不要选择某一波长检测。
（2）加样用排枪，加样时间最好不要超过90 s。裂解液或者Luciferase底物可以预先放入酶标板中，设置好程序后用排枪加另外一种。
（3）Renlia底物是溶于无水乙醇的，极易挥发，如发现液体体积有明显减少，请加入无水乙醇补足体积后保存，即用即盖，计算用量。Renlia与Stop & Reaction buffer现用现配，不要预混。
（4）试剂使用完后注意保存条件，luciferase底物分装后放在-80℃，Renlia放在-20℃。
Q2：荧光值低
A2：（1）转染效率与表达效率：
- 细胞用量低或转染效率低：建议做预实验优化转染条件，如：增加细胞用量，优化转染试剂的用量、DNA/RNA用量和比例、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间，建议在质粒上加GFP作为转染效率验证。
- 质粒表达量低：可以适当减少裂解液用量来提高蛋白浓度，同时设置多个复孔，减少因低浓度造成的孔间差异。
（2）加样速度/即加即检：DL101是闪光型检测试剂，如果不立即测定，荧光容易淬灭，所以推荐排枪加样，加完立即检测。建议提前设置好检测程序（化学发光/luminescence/全波长）
（3）试剂存放：打开使用后，Luciferase分装好避光保存在-80℃，Renilla底物要求放在-20℃，且Renlia底物预先溶解于乙醇中，存放过程需要注意是否存在乙醇挥发的问题。
（4）反应体系要求：反应体系要求细胞裂解液：底物=1:5，如果想要减少底物用量，那么需要对应的减少裂解液用量以平衡反应体系。
Q3：细胞密度较大，裂解不完全，裂解后没办法剥离细胞怎么办？
A3：（1）放在37度裂解，并延长裂解时间，但是也不能裂解太过，能剥离下来就可以；
（2）降低转染时的细胞密度。防止细胞太多，超出裂解液兼容范围，导致裂解不充分的情况发生；
Q4：luciferase和Renilla转染的比例应该是多少，分别转染多少ng？
A4：luciferase和Renilla转染的比例一般为10:1，luciferase转染量根据转染试剂说明书和相关文献确定，可以做预实验根据实验具体情况调整比例，预实验建议海肾载体与萤火虫载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100，萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。
Q5：复孔之间差异大
A5：（1）实验平行复孔（不同细胞孔）：不同孔之间的数值影响因素太多，建议在铺板时尽量把同一批培养的细胞均匀的分布到每一个孔中，同一实验组转染时尽量做mix，避免单孔加样。
（2）来源于同一个细胞孔的裂解液复孔：注意实验操作，加样顺序和速度，加样量。检查排枪加样是否存在不均一问题。
Q6：不同次实验结果差异大
A6：（1）不同次实验中的细胞状态，细胞密度，和实验操作之间都有可能有些许差异，尽量选择同一批次或者相近批次的细胞进行实验，如果最终结果荧光素酶活性相对的趋势是一致的，则没有问题。
（2）在此期间试剂存放是否有问题。
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