Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR
快速高效靶向切割目的片段，无需建库即可实现基因定量。
蛋白质-DNA互作
· 操作体验好：实验流程简单，包含DNA提取模块，告别酚氯仿抽提。
· 产品性能好：转录因子、辅因子成功率高，产出更稳定，结果更真实。
· 结果更准确：含有Spike in DNA组分，校正组间差异。
· 区分下游实验：无需建库，可直接进行qPCR，满足不同实验需求。
Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for PCR/qPCR是用于研究蛋白质-DNA相互作用的试剂盒。CUT&RUN（Cleavage Under Target and Release Using Nuclease）技术是一种研究蛋白质-DNA相互作用的新方法，使用Protein G融合的MNase核酸酶，在抗体引导下精准靶向目的蛋白，并在目的位点附近进行DNA的片段化切割。本试剂盒优化了实验反应体系和操作流程，与传统的ChIP-qPCR相比，具有检测成功率高、抗体兼容性强、实验周期短、操作简单等优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，较大程度上保证了实验结果的稳定性和重复性。
1. 目的蛋白兼容性
以10,000和100,000个239细胞为样本，在不同靶蛋白体系中，针对不同的目的基因富集片段设计qPCR引物，均可以成功进行qPCR扩增。结果表明HD101可兼容不同类型、不同丰度的靶蛋白，目的基因片段富集效果好。
图1 293细胞中H3K4me3、H3K27me3、CTCF、Ezh2互作DNA的富集程度
2. 细胞类型兼容性测试
在293、Hela、K562三种不同细胞类型中，针对组蛋白H3K4me3和转录因子CTCF设计目的基因qPCR引物，可以成功富集目的片段，并进行qPCR扩增，结果表明HD101在不同的细胞类型中发挥稳定。
图2 不同类型细胞中H3K4me3、CTCF互作DNA的富集程度
3. 细胞投入量兼容性测试
投入5,000、10,000、100,000、500,000个293细胞，针对组蛋白H3K4me3和转录因子CTCF设计目的基因qPCR引物，可以成功富集目的片段，并进行qPCR扩增，结果表明HD101在不同的细胞投入量下发挥稳定。
图3 不同细胞投入量下H3K4me3、CTCF互作DNA的富集程度
4. Spike in DNA校准测试
通过梯度投入Spike in DNA（1 pg / 10,000 cells）对不同细胞投入量测得的CT值进行均一化校正，校正后的CT值差值小于1，目的基因富集程度趋于一致。因此，HD101提供的Spike in DNA可实现样本间的均一化校准。
图4 Spike in DNA校正前后CT值的比较
BOX1：2 ~ 8 ℃保存，根据不同目的地调整运输方式；
BOX2：15 ~ 25 ℃保存，常温运输；
BOX3：-30 ~ -15 ℃保存，≤0℃运输。
1. CUT&RUN适用于什么物种?
CUT&RUN Protocol广泛适用于常规哺乳动物细胞的蛋白质-DNA互作研究，酵母、植物等细胞需要经过特殊的处理后进行实验，但是细胞投入量不宜过低，较低细胞投入量下实验结果较差。
2. ConA磁珠主要作用是什么?
ConA磁珠经过刀豆蛋白A包被，能与细胞膜上的糖蛋白结合，从而吸附细胞，使细胞处理操作可视化，以减少在后续实验过程中细胞的损失。
3. CUT&RUN能否使用二抗？
进行CUT&RUN实验时通常不需要二抗，当使用亲和力较低的一抗，或靶蛋白丰度较低时，可以考虑二抗。但必须要说的是，MNase的切割活性很强，我们在CUT&RUN整个实验流程做出的努力是为了限制MNase的活性，较大程度避免非特异性切割，加入二抗会增加非特异性切割的概率，导致背景偏高，因此请慎重选择是否使用二抗。
4. CUT&RUN 对常/异染色质的切割是否存在偏好性？
否，CUT&RUN对常染色质或异染色质无任何偏向性。在CUT&RUN中，无论是常染色质还是异染色质，靶蛋白特异性抗体募集 pG-MNase，并将切割引导至与该抗体直接相邻的染色质。在这种情况下，即使在较难接近的异染色质中，pG-MNase也能与染色质产生有效束缚并发生切割。
5. qPCR熔解曲线出现多峰的原因？
引物设计不优，推荐qPCR引物扩增长度在100 - 200 bp之间，按照引物设计原则进行设计。
6. CUT&RUN实验时需要做阳性对照和阴性对照吗？
根据实际需求判断是否需要阳性对照和阴性对照。一般来说，阳性对照是为了排除实验环境不佳、实验操作不当、样本处理不合格等因素，通常选择丰度较高的组蛋白（如H3K4me3）或转录因子（如CTCF）作为阳性对照，阳性对照不是必需的。阴性对照的作用主要是排除非特异性切割，通常选择IgG或不加一抗作为阴性对照。
7. 在高低丰度组蛋白及转录因子体系中，CUT&RUN-qPCR的测试结果？
以100,000 293细胞为样本，分别对兴奋性组蛋白体系H3K4me3、抑制性组蛋白体系H3K27me3、转录因子体系CTCF和RNA pol II进行CUT&RUN-qPCR实验，结果如下图所示。
图1 不同体系的CUT&RUN-qPCR结果
HD101可以兼容高中低丰度组蛋白以及转录因子体系，可以兼容抑制性组蛋白修饰靶点，低丰度体系为了获得更好的qPCR结果，建议尝试设计多对特异性高且丰度相对较高的qPCR扩增靶点，推荐qPCR引物扩增长度在100 - 200 bp左右，按照引物设计原则进行设计。当IgG CT值与特异性靶点CT值相差较小时，可以通过缩短pG-MNase消化时间、增加细胞投入量以改善实验结果。 若多次CUT&RUN-qPCR结果不理想，可能与目的基因本身的富集程度有关，建议通过文库构建和测序手段判断目的基因是否有富集。
8.CUT&RUN-qPCR数据计算方法和结果体现形式？
推荐采用Fold Enrichment法进行计算，计算方法如下：
（1）统计处理组、对照组、阴性对照组中目的基因的CT值和Spike in DNA的CT值；
（2）以 Spike in DNA为内参，计算各组△CT值。
实验组：△CT treatment = CT treatment - CT treatment Spike in
对照组：△CT control =CT control - CT control Spike in
阴性对照：△CT IgG = CT IgG - CT IgG Spike in
（3）以阴性对照IgG为参照，计算各组2-△△CT值。
Relative Enrichment fold treatment = 2-(△CT treatment - △CT IgG）
Relative Enrichment fold control = 2-(△CT control-△CT IgG）
Relative Enrichment fold IgG = 2-(△CT IgG-△CT IgG）=1
若无处理组和对照组，可直接比较实验组和阴性对照组中目的基因的CT值。以计算CTCF（投入100,000 293细胞）Target基因片段PAX、HLA的富集效果为例：
|
Target |
CT Value |
Average CT |
||
|
PAX |
25.16 |
24.85 |
25.08 |
25.03 |
|
Spike in DNA |
16.53 |
16.52 |
16.74 |
16.59 |
△CT PAX = CT PAX - CT PAX Spike in = 25.03-16.59 = 8.44
|
Target |
CT Value |
Average CT |
||
|
IgG |
27.85 |
27.62 |
27.44 |
27.63 |
|
Spike in DNA |
15.46 |
15.18 |
15.76 |
15.46 |
△CT IgG = CT IgG - CT IgG Spike in = 27.63-15.46 = 12.17
Relative Enrichment fold PAX= 2-(△CT PAX - △CT IgG）= 2-(8.44-12.17) = 13.27
Relative Enrichment fold IgG = 2-(△CT IgG - △CT IgG）= 2-(12.17-12.17) =1
|
Target |
CT Value |
Average CT |
||
|
HLA |
26.87 |
26.85 |
27.02 |
25.06 |
|
Spike in DNA |
16.53 |
16.52 |
16.74 |
16.59 |
△CT HLA = CT HLA - CT HLA Spike in = 25.03-16.59 = 8.47
|
Target |
CT Value |
Average CT |
||
|
IgG |
28.53 |
28.16 |
28.32 |
28.34 |
|
Spike in DNA |
15.46 |
15.18 |
15.76 |
15.46 |
△CT IgG = CT IgG - CT IgG Spike in = 28.34-15.46 = 12.88
Relative Enrichment fold HLA = 2-(△CT HLA - △CT IgG）= 2-(8.47-12.88) = 21.26
Relative Enrichment fold IgG = 2-(△CT IgG - △CT IgG）= 2-(12.88 -12.88) =1
图2 293细胞中PAX、HLA相对富集倍数
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