Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for Illumina
快速高效靶向切割目的片段，文库构建优质且真实。
蛋白质-DNA互作
· 操作体验好：实验流程简单，包含DNA提取模块，告别酚氯仿抽提。
· 产品性能好：转录因子、辅因子成功率高，产出更稳定，结果更真实。
· 结果更准确：含有Spike in DNA组分，校正组间差异。
Hyperactive pG-MNase CUT&RUN Assay Kit for Illumina是针对Illumina高通量测序平台定向开发的用于研究蛋白质-DNA相互作用的试剂盒。CUT&RUN(Cleavage Under Target and Release Using Nuclease)技术是一种研究蛋白质-DNA相互作用的新方法，使用Protein G融合的MNase核酸酶，在抗体引导下精准靶向目的蛋白，并在目的位点附近进行DNA的片段化切割。本试剂盒优化了实验反应体系和建库流程，与传统的ChIP-Seq相比，具有实验成功率高、抗体兼容性强、实验周期短、操作简单等优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，较大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
1. 优质的文库产出
以100,000个K562细胞为样本，参照HD102实验流程对不同丰度靶蛋白进行CUT&RUN实验和文库构建。在不同组蛋白和转录因子体系中，HD102文库产出稳定，文库峰型呈现典型的Ladder状分布，HD102高效靶向切割的特性保证了优质的文库产出。
图1 HD102文库产出
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H3K4me3  |
H3K27me3  |
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CTCF  |
SUZ12  |
图2 HD102文库峰型
2. 高质量的下机数据
以100,000个K562细胞为样本，参照HD102实验流程对不同丰度靶蛋白进行CUT&RUN实验和文库构建。通过HD102获得的下机数据TSS富集以及IGV视图信噪比高，对目的基因位点有明显富集。
图3 HD102 TSS富集图
图4 HD102 Chr1 IGV全局视图
3. Spike in DNA校正组间差异
以5,000、10,000、100,000个293细胞为样本，参照HD102实验流程对组蛋白H3K4me3进行CUT&RUN实验和文库构建，并按照说明书推荐的Spike in DNA投入量进行校正。使用HD102建库获得的热图和Plotfile在校准前由于高低细胞投入量获得的数据量的差异，导致富集效果存在显著差异，通过Spike in DNA进行均一化校准之后，可以真实反应不同细胞投入量下的富集效果。
图5 HD102 Spike in DNA校正前后TSS富集比较
4. 多组学比较
以100,000个293细胞为样本进行CUT&RUN、CUT&Tag、ATAC和mRNA-seq多组学比较分析。IGV视图显示HD102在关键位点上的富集情况与ATAC和CUT&Tag技术一致，且在mRNA-seq中可以找到相应基因位点，实验结果真实可靠。
图6 多组学比较
BOX1：2 ~ 8 ℃保存，根据不同目的地调整运输方式；
BOX2：15 ~ 25 ℃保存，常温运输；
BOX3：-30 ~ -15 ℃保存，≤0℃运输。
1. CUT&RUN适用于什么物种?
CUT&RUN Protocol广泛适用于常规哺乳动物细胞的蛋白质-DNA互作研究，酵母、植物等细胞可以经过特殊的处理来进行实验，但是细胞投入量不宜过低，较低细胞投入量下测序质量较差。
2. ConA磁珠主要作用是什么?
ConA磁珠经过刀豆蛋白A包被，能与细胞膜上的糖蛋白结合，从而吸附细胞，使细胞处理操作可视化，以减少在后续实验过程中细胞的损失。
3. CUT&RUN能否使用二抗？
进行CUT&RUN实验时通常不需要二抗，当使用亲和力较低的一抗，或靶蛋白丰度较低时，可以考虑二抗。但必须要说的是，MNase的切割活性很强，我们在CUT&RUN整个实验流程做出的努力是为了限制MNase的活性，较大程度避免非特异性切割，加入二抗会增加非特异性切割的概率，导致背景偏高，因此请慎重选择是否使用二抗。
4. CUT&RUN对常/异染色质的切割是否存在偏好性？
否，CUT&RUN对常染色质或异染色质无任何偏向性。在CUT&RUN中，无论是常染色质还是异染色质，靶蛋白特异性抗体募集 pG-MNase，并将切割引导至与该抗体直接相邻的染色质。在这种情况下，即使在较难接近的异染色质中，pG-MNase也能与染色质产生有效束缚并发生切割。
5. CUT&RUN是否只能使用Illumina平台测序?
VAHTS DNA Adapters for Illumina对应的Adapter是针对Illumina平台定向设计的，如果需要使用其他测序平台，需自行更换适配相应平台的扩增引物以及适配的Adapter。
6. CUT&RUN试剂盒是否可以使用双端接头？
可以，本试剂盒提供的建库试剂可以兼容单端和双端两种接头试剂，可以根据样本数量以及测序需求进行选择。单端接头推荐使用VAHTS DNA Adapters for Illumina (Vazyme #N801/N802/N805/N806/N807/N808)，双端接头推荐使用VAHTS Multiplex Oligos Set 4/5 for Illumina（Vazyme #N321/N322）,注意区分两种接头试剂的使用方法，并根据细胞投入量和实际DNA提取量进行接头稀释。
7. CUT&RUN实验时需要做阳性对照和阴性对照吗？
根据实际需求判断是否需要阳性对照和阴性对照。一般来说，阳性对照是为了排除实验环境不佳、实验操作不当、样本处理不合格等因素，通常选择丰度较高的组蛋白（如H3K4me3）或转录因子（如CTCF）作为阳性对照，阳性对照不是必需的。阴性对照的作用主要是排除非特异性切割，通常选择IgG或不加一抗作为阴性对照，但下机数据不具有实际参考价值。
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