Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2
一步实现目标质粒不连续多位点（3-5位点）突变
DNA多位点突变
广泛适用：适用于20 kb以内质粒任意位点的扩增
模板使用量低：扩增以指数方式进行，有利于原始甲基化模板的降解
操作简单：扩增产物经DpnI消化后可直接用于重组反应；一步实现目标质粒上3-5个不连续位点(相距超过50 bp)的定点突变
设计简单：提供在线引物设计软件CE Design
使用Mut Express MultiS 进行不连续三点突变实验流程：
以待突变位点A、B、C 为界，将质粒分为AB、BC 和CA 三段。在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物。以原始质粒为模板，分别扩增AB 段(A Forward Primer 和B Reverse Primer)、BC 段(B Forward Primer 和C Reverse Primer) 和CA 段(C Forward Primer和A Reverse Primer) (I)。扩增产物经DpnI消化(I) 后，进行重组环化(II)。重组产物直接进行转化即可完成定点突变(III)。
本试剂盒是基于ClonExpress快速克隆技术的多位点定点突变系统，专门针对多位点定点突变而优化的重组酶和反应缓冲液，可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点同时引入定点突变，操作简便，成功率高。该试剂盒由Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增模块和ClonExpress快速克隆模块组成，扩增模块较高的保真度降低了扩增过程中引入新突变的可能性，高效同源重组技术提高了环化效率。使用本试剂盒进行DNA定点突变时，引物设计灵活、模板需求量低，且如扩增产物特异，DpnI消化后可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。
- 20℃储存
Q1： 点突变引物设计
- 引物由两部分组成：反向互补序列（15-20 bp，GC含量40%-60%）+非互补序列（至少15bp)，待突变位点至引物3'端Tm值>60℃为佳，待突变位点至引物5'端区域内碱基不应参与Tm值计算。
- 引物设计：官网引物设计软件CE Design，选择相应模块进行设计。
Q2：质粒模板无法正常扩增
- 引物设计有误：核对引物设计方案，建议用官网引物设计软件CE Design进行设计。
- 模板质粒：质粒质量偏差会影响扩增效率，长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板（建议质粒模板测序验证序列无问题）；质粒如果太大（>9kb），扩增有一定的难度。
- 扩增体系：质粒模板投入量过多，模板投入量过多会抑制PCR反应，导致PCR产物很少，建议50μl体系投入1ng质粒模板；检查体系配制是否错误。
- 扩增反应条件需优化：调整Mg2+浓度、酶量、摸索退火温度等。
- 若质粒过长不容易扩增或扩增效率极低，可以将单碱基突变方案改为双碱基突变：其中一个位点不进行碱基修改即可。
Q3：平板上长不出克隆或者克隆数很少。
- 感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率需＞107 cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照试验，以检测感受态细胞的转化效率；
- 重组反应体系中DNA量不足或比例不佳（双碱基突变）：尽量按照说明书推荐的量配置重组体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大；
- 重组环化反应体系中DNA不纯，抑制反应：未纯化DpnI消化产物加入重组体系内的总体积不应超过4ul（反应体系体积1/5）。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂（如EDTA）的带入。因此，我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存（常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH2O替代），请勿使用TE进行DNA保存；
- 感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；
- 出现转化抑制效应：当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应，将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。
Q4: 非目标位点突变
- 测序：如果只测了一个样本，不一定可信，需要多测几个样本；检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信。
- 若突变位点一致，可能是模板质粒携带位置为点突变，测序确认模板质粒序列正确性。
- 扩增循环数过多：为了防止扩增过程中引入非目标突变，扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数不应超过30。
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