HiScript II Reverse Transcriptase
具有强耐热性和延伸效率的第二代逆转录酶
逆转录；第一链cDNA合成；RNA 病毒检测；RT-qPCR
· 热稳定性高： 50℃半衰期超过 240 min，55℃半衰期可达 60 min
· 杂质耐受度强： 与其他产品相比，在木聚糖、异硫氰酸胍、CTAB 等杂质存在下，Vazyme #R201 逆转录效率高
· 检测灵敏度好：在不同的引物体系下，Vazyme #R201 检测灵敏度较高
1.高的热稳定性
2.更强的杂质耐受度
以1 μg HeLa 细胞总RNA 为模板，用不同的酶进行逆转录，同时在体系中加入不同浓度的各种反应抑制物。取1 μl cDNA 为模板，AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 扩增human B2M基因，比较各种条件下CT 值大小。更小的CT 值代表更高的逆转录效率，即更高的杂质耐受度。
3.更高的检测灵敏度
以1 μg-1 pg HeLa 细胞总RNA 为模板，用HiScript II Reverse Transcriptase (R201) 做逆转录，取1 μl cDNA为模板，用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix分别扩增B2M基因(A)和EGFR 基因(B)。
本产品是在HiScript Reverse Transcriptase的基础上，通过体外分子进化技术获得的一个新的逆转录酶突变体，其热稳定性和cDNA的合成能力大幅提高。本产品可在50℃的半衰期超过4 h，在55℃长时间反应保持稳定，提高了具有复杂二级结构模板的逆转录成功率。此外，本产品通过多个点突变，进一步增强了模板亲和力和行进性，可获得长达20 kb的cDNA。对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于富含多糖多酚的植物组织RNA的逆转录反应。
-30 ~ -15℃保存。
Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？
A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。
Q2：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？
A2：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。
Q3：如何评判RNA质量？
A3：RNA质量从两个方面反应：
(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。
(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。
Q4：如何选择逆转录的引物？
A4：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。
(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。
cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。
Q5：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？
A5：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。
