HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)
预混液形式的高效的第二代qPCR专用逆转录试剂（去基因组）
第一链cDNA合成；逆转录（含gDNA去除）;基因表达分析；两步法qRT-PCR检测
· 可靠的逆转录效率：高效的HiScript II Reverse Transcriptase具有较强的温度耐受能力，确保在高温条件下能打开RNA 复杂二级结构，得到更长的cDNA
· cDNA合成效率高：Anchored Oligo (dT) 23 VN 设计独特，确保反应特异性，提高第一链cDNA 合成效率和成功率
· 简便快捷的操作：即用型SuperMix 预混液使用方便省时
· 带有基因组去除模块：可有效清除高达500 ng基因组DNA
以HeLa 细胞RNA 为模板，使用Vazyme #R223 和Supplier Ta、Supplier Tg 同类产品，在各自说明书所提供的反应体系及反应条件下进行逆转录，然后用qPCR 检测基因ACTB 和CBR3。结果表明与同类产品相比，Vazyme #R223 在扩增效率和扩增线性上表现都较优异。
本产品是以高性价比的HiScript II Reverse Transcriptase 为基础的两步法qPCR 试剂盒。试剂盒中的4× gDNA wiper Mix可去除残留的基因组DNA，确保了后续定量结果的可靠。5×SuperMix 包含有逆转录反应所需的所有组分，只需加入模板RNA和水即可迅速进行反应，同时终止gDNA wiper作用，保证cDNA的完整性。本产品针对qPCR进行特别优化，逆转录产物兼容SYBR Green染料法和探针qPCR，可以根据实验目的，选择相应的试剂配合使用，进行高性能的基因表达分析。
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Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？
A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。
Q2：逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix，可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组？但如果不进行基因组去除，会影响接下来的逆转录吗？
A2：我们做过100ng基因组的测试，去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行，但是如果基因组残留严重但不去除的话，会影响接下来定量实验的准确性。
Q3：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？
A3：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。
Q4：做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办？
A4：如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除，但No RT Control仍有CT值，可通过实验组和No RT Control组的CT值来判断实验数据是否可用。当实验组CT值与No RT Control对照组CT值差值大于5，说明由gDNA导致的误差小于5%，则可以忽略gDNA污染；若实验组与对照组CT值差值小于3或者几乎一致，则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA，这样的实验组就失去定量意义。
Q5：如何评判RNA质量？
A5：RNA质量从两个方面反应：
(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。
(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。
Q6：如何选择逆转录的引物？
A6：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。
(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。
cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。
Q7：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？
A7：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。
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