HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)
杂质耐受度强、更高效的第三代qPCR专用逆转录预混液（去基因组）
第一链cDNA合成；逆转录；基因表达分析；两步法qRT-PCR检测
· 简便快捷的操作：5 × HiScript III qRT SuperMix包含逆转录反应所需的所有组分，只需加入模板 RNA，18 min内即可完成逆转录反应
· 广泛的模板兼容性：可兼容不同物种，完整度较差的 RNA 模板
· 较强的杂质耐受度：对于逆转录常见杂质如乙醇、异丙醇、水平衡酚、异硫氰酸胍、腐殖酸等，具有较强的耐受度
· 优异的逆转录效率：与常见逆转录产品相比，HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 逆转得到的cDNA定量CT值小，具有优异的逆转录效率
1.简便快捷的操作
HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（Vazyme #R323）包含基因组清除模块，可彻底去除 RNA 模板中残留的基因组 DNA；同时Vazyme #R323 包含逆转录反应所需的所有组分，只需加入模板 RNA，18 min 内即可完成逆转录反应，操作简便快捷。
2.广泛的模板兼容性
分别以 HeLa 细胞、小鼠肝脏、拟南芥叶片的完整 RNA 与降解 RNA 为模板，使用 HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme #R323）以及常见逆转录试剂 (Supplier T) 进行逆转录。将得到的 cDNA 进行多个基因的 qPCR 定量分析，以不同基因为横坐标，扩增 CT 值为纵坐标绘图，比较不同产品的逆转录效率。从图中可以看出，以 HeLa 细胞、小鼠肝脏、拟南芥叶片完整 RNA 以及降解 RNA 为模板进行逆转录定量，Vazyme #R323的扩增CT 值小于或等于T公司相关产品，说明Vazyme #R323逆转不同物种RNA、完整度较差的RNA模板皆具有优异的逆转录效率。
3. 较强的杂质耐受度
在RNA的提取过程中常常因操作或样本的特殊性导致RNA中混有有机试剂或杂质，这些物质的残留会严重影响逆转录效率。乙醇、异丙醇、水平衡酚、异硫氰酸胍、腐殖酸是 RNA 提取过程中较为常见的杂质，测试其对逆转录效率的影响。
分别对上述 5 种杂质设置 3 个不同浓度梯度，添加至 HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme #R323) 逆转录体系中，将得到的 cDNA 进行 qPCR 检测。以不同浓度杂质为横坐标，△CT (△CT = 含杂质逆转录 cDNA 扩增 CT 值 – 未含杂质逆转录 cDNA 扩增 CT 值 ) 为纵坐标绘图。从图中可以看出，△CT 均小于 0.15，说明 Vazyme #R323 对上述 5 种常见杂质具有较强的耐受度。
4. 优异的逆转录效率
以 100 ng HeLa RNA 为模板，使用 HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme #R323) 以及其他逆转录产品，按照各自说明书推荐程序进行逆转录反应。将得到的 cDNA 进行多个基因的 qPCR 定量分析。以不同公司产品为横坐标，△CT (△CT = Vazyme #R323 cDNA 扩增 CT 值 – 各公司逆转录产品 cDNA 扩增 CT 值 ) 为纵坐标绘图。从图中可以看出，除一些体系Th1 △CT ＞0 外，其余公司逆转录产品均△CT ＜0，说明 Vazyme #R323 逆转录效率优于 Ta、Th2、N、P、R、B、Tr、Ti 相关逆转录产品。
本产品包含了全新升级三代逆转录酶和专门针对逆转录特殊优化的 Buffer，可有效提高cDNA合成效率。产品所包含的基因组清除模块可去除RNA模板中残留的基因组DNA，确保后续结果更加可靠。与此同时，本产品将所有逆转录反应所需组分融于一管，只需加入模板 RNA，20min内即可完成逆转录反应，同时终止gDNA wiper作用，保证cDNA的完整性，减少了操作步骤，并有效防止了在操作过程中带来的污染。
- 30℃~- 15℃保存。
Q1：如何评判RNA质量
A1：RNA质量从两个方面进行检测：
⑴ RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA 已完全降解，需要重新提取
⑵ RNA的纯度。RNA的纯度可以通过测定OD260/280和OD260/230两个比值，在1.8-2.1范围内表示纯度较高。
注：建议使用1%的琼脂糖凝胶，210V电泳10-12min；加好loading后的RNA可以放置在PCR仪上70℃，2min，使RNA变性后再进行电泳，这样跑出来的RNA条带更好看，也更能反应RNA的完整性；
Q2：如何选择逆转录的引物
A2：逆转录三种引物：
⑴ 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
⑵ Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
⑶ 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。
引物选择依据: cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端的扩增偏好性。
Q3：对于逆转录加样的操作注意事项
A3：⑴ 4 × gDNA wiper Mix、5 × HiScript III qRT SμperMix及5 × No RT Control Mix含有高浓度的甘油，在使用前请短暂离心收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打充分混匀后准确吸取。
⑵ 20 µl逆转录反应体系建议加入不超过1 µg的Total RNA。如果目的基因表达量非常低，最多加入5 µg total RNA，否则加入RNA量过高， 可能会超出后续定量PCR的线性范围。
⑶ 可以不进行基因组去除步骤，直接用逆转录试剂进行逆转录，但是请勿将4 × gDNA wiper Mix与不含基因组去除模块的试剂配套使用（如与R222配套使用），因为不含基因组去除模块的试剂盒中的Mix不含终止gDNA wiper反应的成分，有可能会影响cDNA稳定性。
Q4：可以通过检测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？
A4：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有bμffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量；cDNA同样不可以纯化，因为逆转得到的cDNA长短不一，纯化会损失短的cDNA。
Q5：cDNA模板需要稀释吗？应该稀释多少倍进行定量？
A5：没有具体的稀释参考倍数，一般cDNA每稀释10倍CT值变大3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行定量实验，根据规律选择CT值落在18-28范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。
注：当使用 cDNA 原液进行检测的时候，使用量不能超过qPCR 反应体系的 1/10，因为 cDNA 中包含很多抑制 qPCR 的组分，cDNA 体积大时风险很高。
Q6：逆转录试剂盒可以用于lncRNA和cirRNA吗？
A6：可以，和普通的RNA逆转类似。不过lncRNA比较长，建议在去除基因组步骤前先进性65℃ 5min预变性，打开二级结构再进行逆转录。并不是所有的LncRNA都包含PolyA 尾，所以如果使用逆转录试剂盒，可以同时添加随机引物与OligodT两种引物，或者只添加随机引物一种引物，但不能只添加Oligo dT一种引物。
cirRNA为环状闭合结构，没有poly A尾，逆转录时只加随机引物。cirRNA长度跨度较大，比较长的话建议跟lncRNA一样先预变形，正常的话就按照正常程序就行了。
关于引物的选择，总的来讲：
mRNA可以选用随机引物+OligodT；随机引物；OligodT；GSP（基因特异性引物）；
cirRNA可以选用随机引物；GSP（基因特异性引物）；
LncRNA可以选用随机引物+OligodT；随机引物；GSP（基因特异性引物）；LncRNA在进行逆转录之前需要进行RNA预变性。
Q7：与二代逆转录产品相比，三代逆转录产品的优势是什么？
A7：（1）与二代产品相比，三代酶CT值偏小1-2 Cycles;
（2）三代产品对于降解的RNA逆转录效率高，可逆转Rin=2.5的RNA；
（3）在高RNA模板（1-5 μg）投入的情况下，依然具有很高的逆转录效率；
（4）对乙醇、异丙醇、酚、异硫氰酸胍（RNA提取中引入的杂质）等常见杂质耐受度极高。
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