ResiDNA Precise Quantitative CHO DNA Detection Kit
可准确定量生物制品中残留的CHO DNA试剂盒
CHO宿主细胞残留DNA定量检测
· 灵敏度高：检出限低至0.3 fg/μl
· 专属性强：对CHO高特异性，外源基因不影响检测
· 耐用性高：DNA的碎片化程度不会对检测结果造成影响
· 高平台：高平台值
ResiDNA Precise Quantitative CHO DNA Detection Kit是一款利用探针法定量检测CHO宿主细胞残留DNA的试剂盒，可用于检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中CHO宿主细胞残留DNA，包含CHO DNA定量参考品，浓度与国家标准品一致，具有特异性强、灵敏度高(可检测fg级)、检测快速、稳定性好及操作便捷等特点。本试剂盒可搭配ResiDNA Hunter Residual DNA Sample Preparation Kit (Vazyme #RD101)使用，用于CHO宿主细胞残留DNA的准确检测。
1. 参考品与CHO国家标准品对齐
每批次试剂盒中的CHO DNA参考品均与国家CHO DNA标准品标定，RD102试剂盒DNA参考品与国家标准品制备标曲基本无偏差，检测值偏差CV<5%。
红色：国家标准品，蓝色：试剂盒参考品
图1 参考品与国家CHO DNA标准品标定扩增曲线
2. 灵敏度高：检出限低至0.3 fg/μl
检测3 fg/μl，1 fg/μl，0.3 fg/μl，0.1 fg/μl的CHO DNA，浓度为0.3 fg/μl及以上浓度复孔的CV值<10%，即CHO DNA残留检测试剂盒的定量限可达0.3 fg/μl。
表1 定量限结果分析
|
|
3 fg/μl |
1 fg/μl |
0.3 fg/μl |
|
Mean |
29.50 |
31.30 |
32.84 |
|
SD |
0.06 |
0.10 |
0.51 |
|
CV |
0.19% |
0.31% |
1.56% |
3. 专属性强：对CHO高特异性，外源基因不影响检测
在含有高达100 ng/μl大鼠（Rat）、人源（Human）、大肠杆菌（E.coli ）基因组干扰的情况下，CHO检测性能仍不受影响。
图2 RD102特异性检测结果分析图
注：背景干扰模板浓度均为100 ng/μl；CHO DNA的浓度梯度均为3 fg/μl-300 pg/μl
4. 耐用性高：DNA 的碎片化程度不会对检测结果造成影响
将CHO DNA标准品，1份作为对照，剩下4份分别进行1、5、10、30 min不同时长的超声处理，获得一系列不同程度碎片化的DNA，将超声的DNA和对照分别稀释成100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl作为模板进行测试，qPCR结果显示DNA碎片化程度不会影响检测结果。
图3 DNA超声破碎结果分析图
左图为：超声获得不同程度碎片化的DNA胶图；右图为：超声获得的DNA qPCR CT值比对
5. 高平台：高平台值
优异的扩增线型，与主流品牌相比较高平台值，低浓度样本仍能有高平台。
红色：Vazyme #R102；蓝色：Supplier A；绿色：Supplier B
图4 不同品牌试剂盒参考品的扩增曲线图
注：CHO参考品的梯度范围均为3 fg/μl-300 pg/μl
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
Q1：扩增效率偏出90% - 110%范围
A1：(1) 如CT(NTC) - CT(SD 6)<3或CT(SD 6) - CT(SD 5)< 3.1，且计算扩增效率超过100%，提示反应体系有污染。绘制标准曲线时，应先根据CT(NTC)确定标准曲线有效CT值范围，舍弃受污染影响的CT，使用剩余的CT绘制。
(2) 不恰当的基线(Baseline)设置会增大CT(SD 1)，进而影响扩增效率计算。手动调整基线(Baseline)为1 - 3循环。
(3) 移液精确度差。
Q2：R2 <0.99
A2：(1) 移液精确度差。
(2) 所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。
Q3：标曲扩增曲线分布不均一
A3：(1) CT (SD 2) - CT (SD 1)<3.1，提示基线(Baseline)设置不当。手动调整基线(Baseline)为1 - 3循环。
(2) SD 1 - SD 6之间的△CT>3.6，提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并彻底混匀；
(3) 确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。
Q4：扩增曲线形状异常
A4：(1) 扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生；提高模板浓度重复实验。
(2) 扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值 - 4)， 重新分析数据。
(3) 个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
Q5：阴性对照出现明显扩增
A5：反应体系污染：更换新的Mix、ddH2O、引物、探针重复实验。
Q6：绝对定量时标准曲线线性关系不佳
A6：参考品降解：更换新的参考品，重复实验。
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