ResiDNA Precise Quantitative Vero DNA Detection Kit
可准确定量生物制品中残留的Vero DNA试剂盒
Vero生物制剂的宿主DNA检测、药物安全性评价
- 灵敏度高：检出限低至0.5 fg/μl
- 专属性强：对Vero高特异性，外源基因不影响检测
- 耐用性高：DNA的碎片化程度不会对检测结果造成影响
- 高平台：高平台值
ResiDNA Precise Quantitative Vero DNA Detection Kit是一款利用探针法定量检测Vero宿主细胞 残留DNA的试剂盒，可用于检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中Vero宿主细胞 残留DNA的专用试剂盒，具有特异性强、灵敏度高(可检测fg级)、稳定性好及操作便捷等特点。 本试剂盒可搭配ResiDNA Hunter Residual DNA Sample Preparation Kit (Vazyme #RD101)使用，用于Vero宿主细胞残留DNA的检测。
1.灵敏度高：检出限低至0.5 fg/μl
检测 30 fg/μl，10 fg/μl，3 fg/μl，1 fg/μl，0.5 fg/μl Vero DNA。0.5 fg/μl 及以上浓度 10 个重复孔的 CV 值<15%，即 Vero DNA 残留检测试剂盒的定量限可达0.5 fg/μl。
表1 定量限结果分析
2.专属性强：对Vero高特异性，外源基因不影响检测
分别评估在含有100 ng CHO、E.coli，以及10 ng NS0 背景DNA基因组干扰下，Vazyme #RD103检测结果显示干扰组与对照组重合，未见干扰。
图1 特异性检测结果分析图
注：Vero DNA的浓度梯度均为3 fg/μl-300 pg/μl
3.耐用性高：DNA 的碎片化程度不会对检测结果造成影响
将Vero DNA标准品，1份作为对照，剩下4份分别进行10 s、1 min、10 min、30 min不同时长的超声处理，获得一系列不同程度碎片化的DNA，将超声的DNA和对照分别稀释成300 pg/μl、30 pg/μl、3 pg/μl、300 fg/μl、30 fg/μl、3 fg/μl作为模板进行测试，qPCR结果显示DNA碎片化程度不会影响检测结果。
图2 DNA超声破碎结果分析图
4.高平台：优异的平台值
优异的扩增线型，与市售主流竞品相比平台值更高，低浓度样本仍能有高平台。
红色：Vazyme #RD103；蓝色：Supplier A；绿色：Supplier B
图3 不同品牌试剂盒参考品的扩增曲线图
注：Vero参考品的梯度范围均为3 fg/μl-300 pg/μl
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组分 |
RD103-01（100 rxns) |
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2 × Vero qPCR Mixa |
2 × 750 μl |
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10 × Vero Primer & Probe Mix |
300 μl |
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Vero DNA Template (30 ng/μl) |
40 μl |
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DNA Dilution Buffer |
7 × 1 ml |
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Negative Control |
1 ml |
a.包含dNTP Mix，Mg2+，热启动Taq酶，通用型校正染料等，该组分在拆包装后需避光保存。
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
Q1：扩增效率偏出90% - 110%范围
A1：(1) 如CT(NTC) - CT(SD 6)<3或CT(SD 6) - CT(SD 5)< 3.1，且计算扩增效率超过100%，提示反应体系有污染。绘制标准曲线时，应先根据CT(NTC)确定标准曲线有效CT值范围，舍弃受污染影响的CT，使用剩余的CT绘制。
(2) 不恰当的基线(Baseline)设置会增大CT(SD 1)，进而影响扩增效率计算。手动调整基线(Baseline)为1 - 3循环。
(3) 移液准确度准确度差。
Q2：R2 <0.99
A2：(1) 移液准确度差。
(2) 所有试剂在使用前应充分解冻并充分混匀。
Q3：标曲扩增曲线分布不均一
A3：(1) CT (SD 2) - CT (SD 1)<3.1，提示基线(Baseline)设置不当。手动调整基线(Baseline)为1 - 3循环。
(2) SD 1 - SD 6之间的△CT>3.6，提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并充分混匀；
(3) 确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。
Q4：扩增曲线形状异常
A4：(1) 扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生；提高模板浓度重复实验。
(2) 扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值 - 4)， 重新分析数据。
(3) 个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
Q5：复孔重复性差
A5：由于移液偏差造成的结果偏差大，可使用反向移液法，即移液枪的2档吸取， 1档排出反应液。
Q6：阴性对照出现明显扩增
A6：反应体系污染：更换新的Mix、Negative Control、引物、探针重复实验。
Q7：绝对定量时标准曲线线性关系不佳
A7：参考品降解：更换新的参考品，重复实验。
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