VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina
高产高质，适配自动化！NR606让您的转录组研究更高效！
RNA文库构建；基因表达分析；单核苷酸变异分析；可变剪切分析；融合基因检测；目标转录组分析
文库产出高：全流程效率升级（逆转录效率、核酸修复效率、接头连接效率、文库扩增效率），可兼容多物种
测序质量好：下机数据好，mRNA占比高
适配自动化：VNL-96P建库成功率高
VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina是针对Illumina高通量测序平台定向开发的转录组文库构建专用试剂盒。试剂盒包含两种类型的cDNA二链合成Buffer，可根据需要选择普通转录组和链特异转录组建库。试剂盒将二链合成、末端修复和dA-Tailing合并为一步，中间不需要纯化步骤，简化了操作流程，缩短了建库时间。优化的反应体系，提高了文库转化效率，能兼容更低起始投入量，对不同起始量的RNA都有均一的覆盖度。
通过对建库过程中各个酶的定向进化与全流程体系的优化，本产品在文库产出、测序质量以及适配性上均得到了显著提升。
1. 文库产出高
以10个物种RNA为模板进行mRNA-seq，相同建库条件下，Vazyme #N403搭配Vazyme#NR606建库产出稳定高于上一代产品Vazyme#NR605。
2. 测序质量好
以10个物种RNA为模板进行mRNA-seq，相同建库条件下，Vazyme #N403搭配Vazyme #NR606下机数据基因检出数与上一代产品Vazyme#NR605基本一致，mRNA占比稳定高于上一代产品Vazyme#NR605。
3. 适配自动化
以293RNA为模板，分别使用手动、自动 (VNL-96P)进行mRNA-seq建库，手动自动建库文库主峰大小一致，产量无明显差异。
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
1. 如果文库浓度过低，可以从哪些角度去寻找原因并如何改进?
以高质量的RNA样品为模板构建得到的文库浓度都能达到上机测序要求,如果无法提供合格的RNA样品,可尝试使用以下方法弥补：
（1）起始量：提高样品起始量;
（2）做几个重复的样品，到片段化步骤合并在一起,或做到PCR前合并在一起;
（3）做不分选方案：94℃ 8 min打断条件下RNA片段虽然偏小，但是分布会很集中，均一性也较好。
2. rRNA残留较高的问题
（1）注意mRNA获取方法的不同,其兼容的起始量有所不同,请选择规格范围内的起始总RNA投入。
（2）注意Input RNA的物种与rRNA去除试剂盒是否兼容。
3. 文库定量常见问题
文库定量有两种方式：Qubit和qPCR分别测定文库质量浓度和文库摩尔浓度。其中由于qPCR利用成簇反应引物进行扩增定量，较为真实的反映出文库中可用于上机测序的DNA片段的数量，所以qPCR得到的文库定量结果较为可信。在qPCR过程单链能够被有效测定，而在Qubit测定时，单链部分不计入有效浓度，因此表现为Qubit测定浓度低于qPCR定量浓度约10% - 50%。一般可同时使用两种方式定量文库，相互校正试剂盒
4. 是否适合用于Small RNA文库制备?
不适用。因为Small RNA的长度仅为22 nt左右,而本试剂盒中磁珠抓取片段为100bp以上,无法有效富集到Small RNA片段。
5. FFPE样本是否可以用该试剂盒建库?
FFPE样本中的mRNA会有一定降解，完整度较差，建议与Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/ Mouse/Rat)(Vazyme #N406)试剂盒搭配使用,进行文库构建。
6. 使用说明书方案进行分选,分选插入片段有偏差,为什么?
使用磁珠分选过程中,磁珠未平衡至室温、未混匀、移液器不准、枪头挂壁严重等均会致使磁珠加入量与规定值不一致,导致所分选的插入片段差异较大。
7. 文库扩增可以使用多少循环?
可根据起始量来调整循环数;如果不确定,建议取1μl进行Qubit检测后酌情再补1-2个循环,建议不超过19个循环。
8. 文库进行Agilent 2100 Bioanalyzer质检,发现产生双峰,产生的原因可能有哪些?
（1）RNA有杂质残留,建库过程中发生降解,到PCR步骤前的有效模板量低,PCR时由于模板不足发生了非特异性扩增。建议将RNA样品在65℃条件下加热15min,检测是否降解,如果确实为RNA的问题则需要重新提取RNA。
（2）物种本身比较特殊,RNA打断后片段不是连续且均一的分布,做分选方案时可能分选到了两个范围的片段。
（3）文库浓度较高时使用高敏芯片检测。建议使用Agilent DNA1000 Kit检测,或将文库稀释到适当的浓度后用Agilent DNA HS Kit检测。
9. 关于在进行Agilent 2100 Bioanalyzer、Qubit及qPCR检测时,高产量文库出现过度扩增的解释。
高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象。因为在文库扩增后期,通常引物被先耗尽, 大量文库片段在无法结合到引物的情况下,片段之间通过不完全匹配关系退火结合,从而形成部分双链+部分单链的杂合链,且片段更大。根据不同检测方式的对应原理,过度扩增产物在Agilent 2100 Bioanalyzer峰型中表现为upper marker之后有轻微翘尾。但以上现象均属正常，不影响文库测序和数据分析。
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