VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit (Premixed Version)
常规RNA建库
VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit (Premixed Version)是针对Illumina及MGI高通量测序平台定向开发的转录组文库构建专用试剂盒。包含两种类型的cDNA二链合成试剂，可根据需要选择普通转录组或链特异转录组建库。在NR606基础上将一链合成、二链合成、接头连接模块Buffer和Enzyme提前预混，操作更加便捷，兼容多物种，实现高产出。
预混版操作便捷：一链合成、二链合成、接头连接模块Buffer和Enzyme提前预混，加样步骤化繁为简；
多物种类型，实现高产出：试剂盒兼容多个物种，峰型稳定，产出无忧；
Illumina、MGI双平台兼容：包含Illumina平台和MGI平台所需Primer，一个建库试剂盒实现双平台建库需求；
适配整套自动化方案：搭配Vazyme #VNL-96P或华大MGISP-960自动化工作站，轻松实现自动化建库。
1. 多物种类型均能达到高产出
以9个物种Total RNA为模板，选用mRNA抓取或rRNA去除路线进行转录组文库构建，参数配置为：打断条件设置为85℃ 6min，接头连接（Vazyme#N342）后0.6×纯化，0.6×/0.1×两轮分选，最终呈现多物种产出较优，整体均一，兼容物种范围更广的优势，测序质量有保障。
图1. NR616多物种测试结果
2. 自动化方案助力，轻松实现无忧建库
投入1500 ng 293 RNA/小麦RNA，使用mRNA抓取路线进行转录组文库构建（Vazyme#N403搭配Vazyme#NR616），接头连接（Vazyme#N321）后0.6×纯化，0.5×/0.1×两轮分选，扩增13个循环；相较于手动建库，自动建库后（Vazyme #VNL-96P），文库产量数据无明显差异。
图2. N403+NR616自动化测试结果
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
Q1：如果文库浓度过低，可以从哪些角度去寻找原因并如何改进?
A1：以高质量的RNA样品为模板构建得到的文库浓度都能达到上机测序要求，如果无法提供合格的RNA样品，可尝试使用以下方法弥补：
① 起始量：提高样品起始量。
② 做几个重复的样品，到片段化步骤合并在一起，或做到PCR前合并在一起。
Q2：rRNA残留较高的问题
A2:① 注意mRNA获取方法的不同，其兼容的起始量有所不同，请选择规格范围内的起始总RNA投入。
② 注意Input RNA的物种与rRNA去除试剂盒是否兼容。
Q3：文库定量常见问题
A3：文库定量有两种方式：Qubit和qPCR分别测定文库质量浓度和文库摩尔浓度。其中由于qPCR利用成簇反应引物进行扩增定量，较为真实的反映出文库中可用于上机测序的DNA片段的数量，所以qPCR得到的文库定量结果较为可信。在qPCR过程单链能够被有效测定，而在Qubit测定时，单链部分不计入有效浓度，因此表现为Qubit测定浓度低于qPCR定量浓度约10% - 50%。一般可同时使用两种方式定量文库，相互校正。
Q4：本试剂盒是否适合用于Small RNA文库制备?
A4：不适用。因为Small RNA的长度仅为22 nt左右，而本试剂盒中磁珠抓取片段最低为100 bp左右，无法有效富集到Small RNA片段。
Q5：FFPE样本是否可以用该试剂盒建库?
A5：FFPE样本中的mRNA会有一定降解，完整度较差，建议与Ribo-off rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Vazyme #N406)试剂盒搭配使用，进行文库构建。
Q6：使用说明书方案进行分选，分选插入片段有偏差，为什么?
A6：使用磁珠分选过程中，磁珠未平衡至室温、未混匀、移液器不准、枪头挂壁严重等均会致使磁珠加入量与规定值不一致，导致所分选的插入片段差异较大。
Q7：文库扩增最高可以使用多少循环?
A7：可根据起始量来调整循环数；如果不确定，建议取1 μl进行Qubit检测后酌情再补1 - 2个循环，最多不超过19个循环。高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象。因为在文库扩增后期，通常引物被最先耗尽，大量文库片段在无法结合到引物的情况下，片段之间通过不完全匹配关系退火结合，从而形成部分双链+部分单链的杂合链，且片段更大。根据不同检测方式的对应原理，过度扩增产物在Agilent 2100 Bioanalyzer峰型中表现为upper marker之后有轻微翘尾。但以上现象均属正常，不影响文库测序和数据分析。
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