UltraClean Pathogen Multiplex AmpSeq Prep Kit for DNA (UDF)
DNA病原tNGS扩增子建库试剂盒（UDF防污染）
洁净防污染，DNA病原tNGS检测多重扩增试剂再升级！
病原tNGS；DNA扩增子建库
UltraClean Pathogen Multiplex AmpSeq Prep Kit for DNA (UDF)是基于两轮PCR法的多重扩增子建库试剂盒，适用于DNA病原微生物检测。本试剂盒以超多重PCR为基础，引入UDF(dU-mediated Double-strand DNA Fragmentation)防污染技术，在保证检出率、扩增特异性、灵敏度和均一性的基础上，可有效防止环境中气溶胶污染的影响。使用本产品完整流程建库耗时可低至3 h，其中手动操作时间<1.5 h，兼容模板起始量为1 - 500 ng，适用的Panel重数为1 - 500重(Panel GC范围为30% - 80%)。本试剂盒适用于Illumina和MGI等主流高通量测序平台。此外，本试剂的原料均经过严格的背景菌质控，可有效预防背景菌引起的扩增干扰，以保证检出结果真实可靠。试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，可保证文库构建的稳定性和重复性。
1）显著的防污染效果：UDF 防污染技术，轻松去除污染
2）优异的扩增性能：检出率高、特异性优、均一性好
3）严格的背景菌控制：车间洁净、人员专业、质控严格
以全 T 和含 dU 的模拟污染物为模板，分别投入 0.1ng，配制 qPCR 体系，在扩增体系中分别添加 UDG 酶、UDF 酶（Vazyme #UNA303所含消化酶）进行 37℃处理 10min，再进行 qPCR 扩增（采用 SYBR Green法)。结果表明，UDF处理组的污染清除效果显著优于UDG处理组。
表1. UDG和UDF消除效率的qPCR对比测试结果
将人293T细胞gDNA和混合病原核酸以1000:1质量比混合构建病原模型（其中，混合病原核酸由11种DNA和RNA病原等质量比混制而成），以其为模板进行两轮PCR，快速程序下完成扩增子文库构建（采用492重病原Panel）。结果显示，Vazyme #UNA303具有优异的检出率、特异性和均一性。
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输
Q1：建库产量偏低
A1：① 确认模板是否降解，重新定量模板，确认模板投入量是否正确，检查引物是否降解。
② 若模板质量较差，可适当提高循环数或使用高质量模板。
③ 若Panel重数较高，可调节扩增程序，如增加退火和延伸时间。
④ 降低退火温度，必要时进行退火温度梯度测试。
⑤ 产物纯化磁珠干燥环节，请勿过分干燥磁珠，磁珠过分干燥会降低DNA洗脱效率，影响产出。
Q2：引物二聚体较高
A2：① 可适当调整引物的使用量。
② 可适当提高模板投入量，减少引物间随机结合概率。
③ 可降低多重扩增后的纯化乘数，纯化乘数可在0.6 - 1 ×之间调整。
Q3：存在非特异性扩增
A3：① 减少循环数。
② 提高退火温度。
③ 减少引物使用量。
④ 重新设计引物。
Q4：部分区域漏检
A4：① 可能设计的Panel与模板的匹配度不够高，建议对设计的Panel进行功能验证。
② 可能模板质量较差，部分区域缺失，需使用高质量模板。
③ 可能引物间GC比例或Tm值差异过大，部分区域扩增困难，建议对不符合条件的Panel重新进行调整。
Q5：文库均一度偏低
A5：① 较短扩增子较少：可适当提高磁珠纯化乘数(提高至1.2 ×或1.5 ×)。
② 较长扩增子较少：可能为模板受损严重或PCR环节扩增不充分，请使用高质量模板或将PCR环节中延伸时间延长。
③ AT含量高的扩增子较少：增加退火时间或降低退火温度，但不建议降至55℃以下。
④ GC含量高的扩增子较少：可以通过在扩增体系中添加5% - 10% DMSO，或者甜菜碱进行调整。
Q6：防污染效率偏低
A6：① 将多重扩增消化阶段的反应时间由10 min调整至15 min。
② 可能原实验室已存在的气溶胶污染对多重扩增产生影响，可以采用核酸清除剂等对实验室进行消杀，去除已有的气溶胶污染。
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