HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)
高效的第二代全长cDNA一链合成试剂盒（去基因组）
逆转录；cDNA一链合成（含gDNA去除）;PCR；qPCR
· 可靠的逆转录效率：高效的HiScript II Reverse Transcriptase具有较强的温度耐受能力，确保在高温条件下能打开RNA 复杂二级结构，得到更长的cDNA
· 宽泛的的模板起始量：从10 pg-5 μg 总RNA，可扩增片段长达15 kb 以上
· cDNA合成效率高：Anchored Oligo(dT) 23 VN 设计结合位点锚定，特异性高，保证第一链cDNA 合成效率和成功率
· 灵活选择引物： 针对不同实验设计可灵活使用不同类型的逆转录引物
· 带有基因组去除模块：可有效清除高达500 ng基因组DNA
分别投入500ng、50ng、5ng HeLa gDNA 使用Vazyme #R212和Supplier T 中基因组去除模块做清除效率检测，结果显示，相对于竞品，Vazyme #R212 中的4 × gDNA wiper 可清除高达500 ng 的基因组残留，并且清除效率达到99% 以上。
本产品是含有基因组DNA去除步骤的cDNA一链合成专用试剂盒，包含有一链cDNA 合成所需的全部试剂。试剂盒中的4 × gDNA wiper可在逆转录步骤前2 min快速去除基因组污染，提高实验结果的可信度；HiScript II Reverse Transcriptase 具有更高的cDNA 合成效率及模板的杂质耐受度，更加适合具有复杂二级结构或低丰度的RNA模板的逆转录；Anchored Oligo(dT) 23 VN设计结合位点锚定，特异性高，保证第一链cDNA 合成效率和成功率。试剂盒中包含单组分逆转录引物Oligo (dT)23VN、Random hexamers，既可合成用于克隆的全长cDNA（可达20 kb），又可合成用于qPCR的各个位置逆转录效率均一的cDNA，用户可根据后续实验需要灵活选择逆转录引物。
-30 ~ -15℃保存。
10 × RT Mix中含有高浓度DTT，低温下可能有沉淀析出。使用前请还原至室温并轻摇混匀，待沉淀重新溶解后使用。
Q1：原核生物RNA能用我们的逆转录试剂吗？
A1：可以。原核生物RNA没有polyA尾，所以在逆转录反应体系中需要以Random primer作为逆转录引物。
Q2：逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix，可以去除残留在RNA中的基因组。最多可以去除多少的基因组？但如果不进行基因组去除，会影响接下来的逆转录吗？
A2：我们做过100ng基因组的测试，去除效率是99.95%。如果不进行基因组去除不会影响逆转录实验的进行，但是如果基因组残留严重但不去除的话，会影响接下来定量实验的准确性。
Q3：延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？
A3：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些GC含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。
Q4：做了No RT Control发现有gDNA残留怎么办？
A4：如果使用试剂盒中的gDNA wiper模块进行gDNA去除，但No RT Control仍有CT值，可通过实验组和No RT Control组的CT值来判断实验数据是否可用。当实验组CT值与No RT Control对照组CT值差值大于5，说明由gDNA导致的误差小于5%，则可以忽略gDNA污染；若实验组与对照组CT值差值小于3或者几乎一致，则实验组扩增产物的模板很大一部分来源于gDNA，这样的实验组就失去定量意义。
Q5：如何评判RNA质量？
A5：RNA质量从两个方面反应：
(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。
(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。
Q6：如何选择逆转录的引物？
A6：根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT或基因特异性引物进行逆转录。
(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
(2) Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。
cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。
Q7：可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？
A7：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有buffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。
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