Cas9 Nuclease
高纯度高活性的Cas9 蛋白
体外 sgRNA 效率验证
· 高纯度高活性的Cas9蛋白
· 方便应用于体外sgRNA效率验证
琼脂糖凝胶电泳分析10,937 bp 双链DNA 片段被Cas9 Nuclease 体外切割后的结果。
M1: DL15,000 DNA Marker，
M2: DL5,000 DNA Marker
本产品是克隆Streptococcus pyogenes 的Cas9 基因后在大肠杆菌中表达纯化的高纯度Cas9 活性蛋白。Cas9 Nuclease 是一个RNA 导向的序列特异性双链DNA 内切酶。向导RNA 通过与靶序列互补来识别靶位点，并将Cas9 Nuclease 带到靶DNA 上。Cas9 Nuclease 有两个切割活性中心，分别切割靶DNA 的两条链从而产生DNA 双链断裂。切割位点为靶向区域内与NGG(PAM) 相距三个碱基处。
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Q1: 为什么观察到条带切割不完全?
A1: (1) 可能是由于Cas9 Nuclease、sgRNA、target DNA的比例不对引起的，我们推荐Cas9 Nuclease、sgRNA、target DNA的摩尔比例至少为10:10:1；
- 可能与sgRNA的序列有关，可以根据target DNA选择sgRNA序列；
- 可能由于sgRNA降解引起的，可以通过凝胶电泳验证sgRNA的完整性。
Q2: EN301中的50pmol和250pmol怎么转换成质量？
A2: 以50pmol为例：
Cas9蛋白分子量：160kDa，换算为160000 g/mol(1kDa ≈ 1000 g/mol)
50 pmol质量换算公式：50×10-12 mol×160000 g/mol=8×10-6 g
质量浓度=质量/体积=8×10-6 g/50 ul=160 ng/ul，通过这个公式进行换算就可以了。
Q3: 胶图显示没有目的切割片段，只有弥散条带，且在模板之上有较亮条带。
A3: 因为Cas9切割之后，蛋白和DNA还结合在一起，所以直接电泳会有smear或者分不开，clean up或者加热能让蛋白和DNA分开，跑胶就会有明显分开的DNA。
建议：首先确认条带要正确，marker正确；95度加热5分钟再跑胶；如果还不行，把酶切产物回收一下再跑胶。
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