T7 High Yield RNA Transcription Kit
用于体外RNA 合成
体外 RNA 的合成；产物可用于RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交等
· 优化的反应体系
· 每个反应产生高达150-200 μg的RNA产物
图1. 逆转录方案
图2. 反应时间与产量的关系
图3. 模板投入量与产量关系
T7 High Yield Transcription Kit 是优化的体外转录试剂盒，T7 RNA Polymerase 从模板DNA T7 的启动子下游开始合成与DNA 中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA 分子，转录时可在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。本试剂盒以0.5μg 的模板投入量可以产生150 μg-200 μg 的RNA，转录合成的RNA 可用于诸如RNA 结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。
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1. 模板选择
带有双链T7启动子的线性化质粒、PCR产物或者合成的DNA片段都可以作为T7 体外转录模板，推荐浓度0.5 μg/ul；
（1）质粒：质粒必须完全线性化，可以使用酶切或者反向PCR得到线性化的质粒，线性化的质粒请确保双链为平末端或编码链5’端为突出结构。 质粒线性化后，建议纯化后再作为模板体外转录，以避免RNase、蛋白、RNA及盐残留对体系的影响。每个反应建议投入1 µg线性化质粒作模板；
（2）PCR产物模板：需电泳确认产物的单一性，建议每个反应体系中投入0.1 - 0.5 µg 模板；
（3）合成的DNA模板： 推荐每个反应体系中投入0.1 - 0.5 µg 模板。
2. 转录产物产量低可能的原因及建议。
（1）产物长度小于300nt时，建议提高产物的投入量至2μg，适当延长反应时间。
（2）阳性对照，试剂盒中提供的阳性模板大小在500bp左右，对于阳性对照的实验设计可以在选择反应2h后从20μl的体系中取出5-10μl确定产量，剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确定产量。
（3）不同的纯化方式产生的损失是不同的。
（4）实验模板本身原因导致产量低，请尝试以下方案解决：
a. 重新纯化模板；
b. 确定模板定量以及其完整性；
c. 延长37℃反应时间；
d. 加大模板投入量；
e. 尝试其它的启动子和RNA 聚合酶。
3. 短片段转录产物产量低
转录起始片段短会抑制反应，转录产物小于0.3 kb 时，延长反应时间或增加模板量可以提高RNA 产量，过夜反应(16 h) 或者使用2 μg 模板可以使RNA 产量最大化。
4. 产物电泳拖尾现象
电泳过程中有拖尾现象，可能原因:
a. 实验操作过程被RNA酶污染；
b. DNA模板被RNase污染：体系中的RNA 酶抑制剂只能抑制痕量的RNA 酶残留；
c.建议重新纯化模板DNA，并在实验过程中使用RNase-free 的枪头和EP 管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H2O 配制。
5. RNA 产物片段大于预期
如果电泳显示产物条带大于预期，可能原因：
a. 质粒模板可能没有完全线性化；
b. 有义链3’端为突出结构；
c. RNA 存在未完全变性的二级结构；
建议确认模板结构，并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA 产物。
6. RNA 产物片段小于预期
如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：
a. 模板序列中包含类似于T7 RNA 聚合酶的终止序列；
b. 模板中GC 含量高形成高级结构；
c. RNase 污染；
不同的聚合酶识别不同的终止序列，若是模板中含有终止结构，建议尝试不同的RNA 聚合酶。如果模板为高GC，建议加入SSB 蛋白，以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致，请跑变性胶检测产物。
7. 针对大片段和小片段，转录的效率如何？
大片段会出现条带弥散的情况，因为片段越长酶越容易从模板上脱落，所以得到的产物条带就不是那么集中，其他竞品公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的，较短的转录其实对反应有抑制作用，所以要适当延长反应时间，可以过夜16h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间，所以模板太短时会对反应造成抑制作用，同时建议增加模板量至2μg。
8. sgRNA条带模糊。
sgRNA是100nt左右的单链RNA，在水溶液中容易形成二级结构，因此电泳时会位置会发生变化，采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。
9. 模板中间有一段Poly T中止序列，后面的序列可以转录出来吗？
模板中有发卡结构会影响转录，序列一般不会影响转录。
10. 使用TR101时的模板一定要是双链吗？
至少T7启动子要是双链的。
11. 使用质粒作为模板时，在线性化的过程中，为什么需要使用平末端或者5’突出末端的限制性内切酶进行线性化？
原因和环状质粒为模板相似，都是会因为没有终止子而无限循环下去，从而导致生成的产物片段大小不一。
12. 体外转录试剂盒适用的片段范围是多少？
最小做过21bp的siRNA（TR102）,最大做过10kb。
13. 模板中存在高级结构（高GC或是茎环结构），怎么做可以提高产量？
提高温度，如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。
14. 模板中存在类似于T7终止序列（也是一种茎环结构）怎么做可以提高产量？
降低反应温度。
15. 合成的RNA纯化方式？
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方式 |
优点 |
缺点 |
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酚/氯仿 |
便宜 |
可能会残留游离的核苷酸 |
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柱提法 |
将游离的核苷酸去除干净 |
贵 |
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切胶回收 |
产物均一 |
- |
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磁珠法（推荐） |
快速且回收率高 |
- |
16. TR101可以用于合成mRNA吗？
可以，但是要自己购买帽子类似物，说明书中提供的加帽RNA体系就是合成mRNA的体系，里面GTP和加帽类似物的浓度比例建议为1:4。
17. 模板投入量增加为2μg时，NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整？
模板投入量增加为2μg时，NTP的量不用调整，若担心模板消化不彻底，可将DNA酶的量从1μl提高至3μl；
18. 阳性对照模板大小是多少？对照组投入0.5μg产出是多少？
Control Template的长度约500bp，投入0.5μg，产出约150-200μg，最低130μg（转录后直接用Qubit测量浓度）。
19. TR101中，有预混RNase 抑制剂吗？
转录酶有预混的RNase 抑制剂，体系中的RNA 酶抑制剂只能抑制痕量的RNA 酶残留，建议在实验过程中使用RNase-free 的枪头和EP 管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H2O 配制，从而避免RNase的污染。
20. TR101可以合成dsRNA吗？
可以，但是TR101里面少一个酶（RNase T1：作用是降解单链RNA和5’端的3个G碱基），所以得到的dsRNA里面会有单链RNA，并且产物5’端有3个G碱基。
21. T7启动子后面带有三个GGG的作用是什么？
GGG的作用是提高转录效率的。
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