T7 RNAi Transcription Kit
用于体外dsRNA 合成
siRNA及长链dsRNA的体外转录；产物可用于RNAi实验
· 可以转录siRNA和长片段dsRNA；
· 产量高达20-80 μg；
· RNA磁珠可快速高效的纯化转录产物
图1. 500 bp dsRNA 2%琼脂糖凝胶电泳图
1：DL2000 Plus DNA Marker；2和4：500 bp dsRNA酶解前后产物（双端转）；3和5: 500 bp dsRNA酶解前后产物（混合转）。
图2. siRNA 12% PAGE电泳检测结果
1：siRNA转录产物；2：siRNA转录双酶消化产物；3：单链模板；4：双链退火模板
图3. siRNA干扰绿色荧光蛋白表达
左图为GFP质粒与negative control GFP siRNA共转染24 h后的293T细胞；右图为GFP质粒和positive GFP siRNA共转染24 h后的293T细胞。
T7 RNA ploymerase可识别带有T7启动子的DNA模版，以四种NTP 为底物，体外转录合成RNA。T7 RNAi Transcription Kit 是在T7 High Yield RNA Transcription Kit 基础上为转录双链RNA 而设计优化的版本，可用于转录21 bp 的siRNA 和长片段的dsRNA。转录产物经纯化后可用于阳离子脂质体、磷酸钙共沉淀、电穿孔、DEAE- 葡聚糖及显微注射等方法介导的RNAi 实验。一般情况下，一个反应可产生20 μg-80 μg 的RNA。
Box 1 于-20℃保存，Box 2 于4℃保存。
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1. dsRNA 实验方案设计
dsRNA的实验设计有三种方案，
- 模板1和模板2分别在两个PCR管中转录后再将产物1:1退火成双链；
- 模板1和模板2在同一个PCR管中混合转录后退火成双链；
- 用双端带启动子的模板3转录后退火成双链；
一般情况下，方案（1）和（2）的转录产物量更高。若选择方案（1）和（2），模板投入量请按照1:1的比例进行转录，否则产物正义链和负义链RNA的量不相等，退火后会残余较多的单链RNA。
2. siRNA 模板链设计
siRNA由于转录模板比较短，所以通常采用化学合成的方式得到四条单链DNA模板， 再两两退火成转录模板。siRNA 3’末端带两个游离的碱基会提高siRNA与mRNA的结合效率，游离碱基为UU时对靶基因的抑制效果最强，若游离碱基为GG则细胞内的RNase会降解这种结构，导致siRNA活性降低。
siRNA 3’端带有两个游离碱基，推荐在设计模板时在模板链3’端加两个A碱基。siRNA 的模板链包含：6个碱基的增强子、20个碱基的T7启动子、19-21个碱基的目标序列及2个游离的T碱基。结构如下所示：
|
增强子 |
T7启动子 |
特定序列 |
|
GATCAC |
TAATACGACTCACTATAGGG |
X19-21TT |
3. 转录产物产量低
一般情况下，每个反应可以产生20-80 µg 的RNA，如果实验组产量很低，可能原因：
- 模板中含有抑制反应的成分；
- 模板投入量，模板长度及模板结构均与产量密切相关。 若对照组产量正常但实验组产量低，说明实验模板本身原因导致产量低，请尝试以下方案解决：
- 纯化模板，并对模板准确定量；
- 加大模板投入量；
- 延长37°C 反应时间；
- 重新设计模板。
4. 短片段模板转录产量低
模板片段小，模板与酶的结合效率会较低，如合成siRNA 比合成其他长度的单双链RNA 产量低。建议适当延长反应时间或增加模板量以提高RNA 产量。
5. 产物电泳拖尾现象
电泳过程中有拖尾现象，可能原因是模板投入量较多或者两个模板不以1:1 投入而导致模板或者单链RNA 酶解不彻底，建议适当延长双酶解时间。模板与单链RNA 在总的转录产物中含量极低，一般不会影响后续实验。
6. 转录产物条带不单一
- 转录产物存在不同高级结构：建议用变性胶进行电泳，或者RNA经过加热变形后再跑胶；
- 转录时产生非特异性产物：如果不影响下游实验可忽略，若担心影响下游实验可切胶回收；
- 合成的dsRNA产物不特异：建议使用说明书中转录方案一（模板1和模板2分别在两个PCR管中转录后，定量后再将产物1:1退火成双链）；模板浓度不统一，导致转录出的两条链产量不一致；两条链转录效率不一致（属正常现象），有未退火的单链，用试剂盒中提供的酶消化可以消除。
7. TR102最长可以合成多长的RNA？
体外转录TR102的长片段dsRNA最长10kb以内。
8. 若合成模板的长度为50bp，反应时间建议为多少？
建议时间为4h,产量基本上可以满足需求。一般来说，合成小于0.3 Kb的RNA，可将反应延长至4 h或更长时间，过夜也是可以的，但产量不会多很多
9. dsRNA需要进行额外的退火步骤吗？
同一个PCR管中，小于800 bp的转录产物反应后会互补形成dsRNA，大于800 bp需要退火形成dsRNA。两个模板分别在不同的PCR管中转录，则需将反应结束后两个产物混合后进行退火。
10. TR102是否可以体外转录单链RNA？
TR102可以做体外转录单链RNA，TR102试剂盒比TR101试剂盒多了2个模块，即：10 x Annealing Buffer、RNase T1（RNase T1特异性降解单链RNA中的G及双链中5’端的3个G游离的碱基），去掉这几个模块，可以参照TR101的说明书操作。
这里使用TR102组份，以说明书TR101中的非修饰RNA体系配制为例：
- 反应体系
|
组份 |
体积 |
|
10 × Transcription Buffer |
2 μl |
|
NTP Mix |
8μl |
|
DNA模板 |
x μl |
|
T7 Enzyme Mix |
2 μl |
|
RNase-free H2O |
up to 20 μl |
- 后续的步骤均参照说明书操作即可。
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