Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit
Annexin V-PE/7-AAD 凋亡检测，可区分早凋和晚凋
贴壁及悬浮培养细胞的凋亡检测；区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞
染色特异性强
试剂盒中含有7-AAD，可与Annexin V -PE配合区分早凋/ 晚凋细胞
图1. Annexin V-PE/7-AAD染色检测凋亡效果图
图 A. 未经喜树碱诱导的Jurkat 细胞，用Annexin V-PE 和7-AAD双染后流式二维图（左）与直方图（右）；
图 B. 用终浓度为4 μM 的喜树碱诱导Jurkat 细胞凋亡4 h，用Annexin V-PE 和7-AAD双染后流式二维图（左）以及直方图（右）。
图2. Annexin V-PE/7-AAD染色检测不同程度凋亡
用喜树碱（Camptothecin，CPT）诱导Jurkat细胞（人T淋巴瘤细胞）凋亡，诱导浓度分别为0、4、8、12、16μM，分别诱导4小时后，参照产品说明书实验方案进行染色，用流式细胞仪检测结果如图2。
(A)0μM. (B)4μM.(C)8μM.(D)12μM.(E)16μM.(F)竞争封闭实验，采用16μM CPT诱导Jurkat细胞4小时后，参照说明书收集并洗涤细胞，于染色前加入无染料标记的Annexin V蛋白孵育10分钟，再进行Annexin V-PE/7-AAD染色。无染料标记的Annexin V结合了细胞上的PS，再进行染色时，Annexin V-PE无法结合PS，这说明了染色的特异性。
在正常细胞中，磷酯酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由内侧外翻至外侧，从而将PS暴露于细胞外部环境。Annexin V是一种35 - 36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS具有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的细胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V以藻红蛋白(Phycoerythrin, PE)进行标记，标记后的Annexin V保留了与PS的高亲和力，可作为探针，利用流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。由于在凋亡早期即发生PS外翻，故Annexin V-PE染色在凋亡早期就能识别出凋亡的发生。7-氨基放线菌素(7-AAD)是一种核酸染料，7-AAD不能透过正常细胞或早期凋亡细胞完整的细胞膜，但可穿透膜损伤细胞如晚期凋亡细胞或者坏死细胞的细胞膜并与其内的DNA结合，可用来区分早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞或坏死细胞。因此将Annexin V-PE与7-AAD进行共染，就可以区分不同凋亡时期的细胞。
本试剂盒所有组分均在2 - 8℃保存，Annexin V-PE和7-AAD Staining Solution需避光保存，勿冷冻。
Q1：Annexin V-PE染色失败或者阳性率偏低。
首先要确定实验中使用的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
Annexin V-PE染色失败，最常见的实验操作原因是贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca2+，Binding Buffer中含有2.5 mM的Ca2+，含EDTA的胰酶消化会影响染色，建议使用无EDTA的胰酶。若使用含EDTA的胰酶，必须通过洗涤步骤彻底去除EDTA。
用PBS洗涤细胞沉淀后，应尽量去除残余液体。残留PBS中的磷酸根，会形成磷酸钙沉淀。
Binding Buffer的瓶盖要紧闭，防止空气中的CO2进入后形成碳酸钙沉淀，减少游离Ca2+，导致实验失败。
接触其他缓冲液如吸取PBS后不更换枪头也会导致游离的Ca2+减少。
一些细胞其细胞膜上PS的密度较低，染色效果很差，此时建议更换细胞株或者采用TUNEL试剂盒（Vazyme Biotech Co.,Ltd-A111/A112/A113）检测凋亡。
如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞也要收集，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。
Q2：假阳性
实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后Annexin V-PE/7-AAD双阳性比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力低。建议用台盼蓝染色计算细胞活力，阴性对照台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若细胞活力低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少应传代2 - 3次以后才能进行实验。
另一可能是细胞操作不当引起，操作过程中吹打细胞过于剧烈，贴壁细胞消化过程中消化时间过长，均可能导致细胞膜破坏，出现假阳性。
此外，一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48 h以上；诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。
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