ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V3
方便高效的快速克隆试剂盒
快速克隆，高通量克隆，无缝克隆；载体构建，同源重组
ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆技术，利用重组酶可快速将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。本试剂盒采用新优化的2 × CE Mix V3，可以高效兼容1 - 11个DNA片段的同源重组，在保证了大载体、高低GC同源臂等复杂体系的高克隆成功率的同时，进一步显著提升了对DNA投入量的兼容性，减轻了由于DNA片段浓度低导致克隆效率下降的困扰。
高效准确：5 - 30 min完成重组，克隆数多、阳性率高
方便通用：一管式Mix快速加样，实现1 - 11个片段的高通量重组
高灵活性：兼容0.003 - 0.25 pmol的片段投入量、10% - 85%的GC同源臂，以及纯度差或未纯化体系等，减轻实验样本问题带来的困扰
1. 高效准确：克隆数多、阳性率高
（1）测试近30个体系，Vazyme #C117克隆数均优于同类型产品Supplier A、Supplier B和Supplier C。
图1. Vazyme #C117与同类型产品克隆数比对（仅展示部分体系）
（2）测试近30个体系，Vazyme #C117阳性率均在95%以上。
图2. Vazyme #C117阳性率情况（仅展示部分体系）
注：图中碱基数代表阳性克隆菌检条带大小
2.高灵活性：兼容低投入量/低浓度样本
测试不同体系在常规投入量的1/10条件下，Vazyme #C117克隆数和阳性率均显著优于同类型产品Supplier A、Supplier B和Supplier C。
图3. Vazyme #C117与同类型产品克隆数比对（仅展示部分低投*体系）
注：“低投”单片段体系投入量-载体0.003 pmol，片段0.006 pmol；多片段体系投入量-片段/载体各0.003 pmol
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
Q1：引物如何设计?
① 引物设计：推荐引物设计软件CE Design，选择相应模块进行设计。
② 引物三部分：同源臂(15 - 20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40% - 60%) +酶切点(根据实验需求保留或者删除) + 特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。
Q2：平板上未长出克隆或克隆数目很少。
① 引物设计不正确：引物包含15 - 20 bp同源臂(不计算酶切位点)，GC含量40% - 60%。
② 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照说明书中推荐的量和比例配制重组反应体系。
③ 载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA使用体积不应超过2 μl(反应体系体积的1/5)；建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。
④ 感受态细胞效率低：感受态细胞的转化效率需>108 cfu/μg。可进行简单检测，转化0.1 ng质粒，取1/10进行涂板，生长1,000个菌斑，估算转化效率为108 cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞(如Fast-T1/DH5α)，不能选择表达感受态细胞。
Q3：多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段。
① PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。
② 克隆载体线性化不完全：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物。
③ 反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐Dpn I 消化(推荐SwiftCut Dpn I，Vazyme #C404)，或者对扩增产物进行胶回收纯化。
Q4：菌落PCR无条带。
① 引物不正确：推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
② PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。
③ 重组失败：只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。
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