ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2
兼容高效的快速克隆试剂盒
快速克隆、高通量克隆、无缝克隆；载体构建、同源重组
· 兼容：1-5个片段，长同源臂、同源臂高GC/高AT、未纯化体系
· 高效：5-30min完成重组，克隆数多、阳性率高
ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆技术，可快速将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。Vazyme #C116是新一代的快速克隆试剂盒，可以高效兼容1-5个片段同源重组，使用高度优化的2 × CE Mix，50℃反应5 - 30 min即可进行连接，对同源臂长度、同源臂GC含量、未纯化体系等兼容性更广，提高了复杂体系的克隆成功率。
1. 克隆数多
测试19个体系，Vazyme #C116克隆数均优于同类型产品Supplier A、Supplier B和Supplier C；测试9个体系，Vazyme #C116克隆数均优于同类型产品Supplier D。
图1. Vazyme #C116与同类型产品克隆数比对（仅展示部分体系）
2. 阳性率高
测试30个体系，Vazyme #C116阳性率在90%以上。
图2. Vazyme #C116阳性率鉴定（仅展示部分体系）
3. 兼容性广
测试同源臂GC含量为86.7%/6.7%的体系、同源臂长度为35bp的体系及片段未纯化体系，阳性率皆在90%以上。
图3. Vazyme #C116兼容性测试
注：“+”前面数字表示载体大小，pCE-V为3957bp；“+”后面数字表示片段大小，带“*”表示为多片段插入
-30 ~ -15℃保存
Q1：引物如何设计
1. 引物由三部分组成：同源臂（15-20 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40%-60%）+酶切位点（按需保留或舍弃）+特异性引物（引物Tm值由特异性序列决定，计算不包括同源臂的序列）
2. 引物设计：官网引物设计软件CE Design，选择相应模块进行设计。
3. 载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切和反向PCR，优先选择双酶切。
Q2：阳性对照不长克隆或很少。
1. 平板抗性使用错误：C112，C113提供的对照载体的抗性为Amp+抗性；C115提供的对照载体的抗性为Amp+，Kan+双抗性；C116提供的对照载体的抗性为Amp+抗性。
2. 感受态细胞效率低：感受态细胞的转化效率需大于108 cfu/μg。可进行简单检测，转化0.1 ng 质粒，取1/10进行涂板，生长1,000个菌斑，估算转化效率为108 cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞
(如Fast-T1/DH5α/XL10)，不能选择表达感受态细胞。
Q3：平板上未长出克隆或克隆数很少
1. 引物设计不正确：引物包含15 - 20 bp同源臂(不计算酶切位点和残留碱基)，GC含量40% - 60%。
2. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照说明书中推荐的量和比例配制重组反应体系。
3. 载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA使用体积不应超过2 μl(反应体系体积的1/5)； 建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。
4. 感受态细胞效率低：感受态细胞的转化效率需大于108 cfu/μg。可进行简单检测，转化0.1 ng 质粒，取1/10进行涂板，生长1,000个菌斑，估算转化效率为108 cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞
(如Fast-T1/DH5α/XL10)，不能选择表达感受态细胞。
Q4：假阳性/测序无信号/空载体
1. 质粒载体残留导致的假阳性：设置阴性对照来排查，如果阴性对照长了很多，可能是模板投入量过多或者未进行Dpn I 消化。
若以质粒为模板PCR获得片段/载体：质粒投入量不宜过多(<1ng)，否则可能导致Dpn I消化不完全从而造成假阳性。建议PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O中。
2. 挑斑方法不合适：重组产物3'端与5'端未连接，需要到感受态细胞中进行修复，斑点相对来说会小点；平板营养不均匀会导致斑点大小有差异；重组质粒相对原始质粒来说，有可能会影响细胞的生长。建议选取平板上某一块区域，同时挑选大斑和小斑，以增加挑到重组产物的概率。
3. 菌检引物不合适：建议使用载体通用引物或者引物一端在载体上，一端在目的片段上。如果用目的片段引物进行菌液PCR，可能会出现菌检有结果而测序无结果。
Q5：菌液PCR无条带
1. 引物不正确：推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
2. PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。
3. 重组失败：只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。
Q6：多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段
1. PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。
2. 克隆载体线性化不完全：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物。
3. 反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐Dpn I 消化，或者对扩增产物进行胶回收纯化。
Q7：插入片段出现碱基突变
1. 测序的样本数：如果只测了一个样本，不一定可信，需要多测几个样本。
2. 分析测序结果：检查突变处的测序信号是否有问题，若为双峰或者杂峰则不一定可信。
3. 检查突变位点：如果多个结果突变位点一致，可能是从模板上引入的或者模板序列与NCBI上不一致。
4. 插入片段在PCR获得时建议使用高保真聚合酶。
5. 若引物处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议重新合成引物进行实验。
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