2 × Phanta UniFi Master Mix 通用型超高保真酶预混液 (P516)
2 × Phanta UniFi Master Mix（Dye Plus）通用型超高保真酶预混液（蓝色） (P526)
220倍保真度的通用型超高保真酶预混液
* P516/P526仅产品形式不同，产品性能相同
克隆、鉴定、基因合成、NGS
Phanta UniFi DNA Polymerase是基于BioSmart平台精心筛选出的一款新一代高保真DNA聚合酶，兼具高保真度和广泛的Tm值兼容性。 结合新一代热启动技术和适宜的缓冲体系，该产品在特定的通用退火温度下展现出优异的成功率和特异性，能够稳定扩增各种靶标。其保真度是Taq酶的220倍，为分子克隆、测序和定点突变等需要准确扩增的PCR实验提供了高效和便捷的解决方案。2 × Phanta UniFi Master Mix / 2 × Phanta UniFi Master Mix（Dye Plus）是一款预混液，包含Phanta UniFi DNA Polymerase、dNTP和Mg2+等PCR反应组分。只需加入模板和引物，即可进行扩增，从而减少移液步骤，提高检测通量和结果的稳定性。该产品适用于常规模板、粗品以及高GC含量体系(包括引物和模板)。此外，2 × Phanta UniFi Master Mix (Dye Plus)内含电泳指示剂，可在PCR反应完成后直接进行电泳分析。
高保真度：保真度约为Taq酶的220倍
通用程序：一台PCR仪，即可同时扩增多对不同长度/不同Tm值的基因
快速扩增：单重：<10 kb、15 s/kb， ≥10 kb 、30 s/kb；多重：<2 kb、30 s/kb
兼容性广：适用于常规模板、粗品、高AT/高GC及多重体系的扩增
室温稳定：可室温配制，配制好的体系室温放置24 h扩增性能不变
1. 高保真度
采用二代测序方法（P. Mielinis. et al. Journal of Molecular Biology (2021)），测定不同聚合酶的扩增保真度。结果显示， Phanta UniFi DNA Polymerase保真度是Taq DNA Polymerase的220倍。
2.通用程序
使用2 × Phanta UniFi Master Mix（Vazyme #P516，简称P516）/2 × Phanta UniFi Master Mix (Dye Plus)（Vazyme #P526，简称P526）及市售同类高保真酶（Supplier A、Supplier B、Supplier C）进行平行比对。结果显示：P516/P526拥有广泛的Tm值兼容性并优于Supplier A、Supplier B及Supplier C；P516/P526可在一台PCR仪中同时成功扩增多个不同长度/不同Tm值的片段。
3.兼容性广
P516/P526可成功扩增 17.5 kb gDNA，18.2 kb质粒，17.8 kb λDNA，15 kb cDNA；整体GC兼容范围为24%-79%，局部为22%-100%；可兼容大肠杆菌菌液、毕赤酵母菌液、鼠尾裂解液、水稻裂解液及全血等粗品直扩；可兼容2 kb以内的17重扩增；且P516/P526成功率、特异性优于Supplier A、Supplier B及Supplier C。
4.室温稳定
P516/P526可兼容室温配制，反应体系室温配制且室温放置24 h扩增性能不变。
-30~-15℃保存，≤0℃运输
Q1：引物设计原则？
A1：引物长度建议为21 - 25 nt，且引物3'端最后一个碱基最好为G或者C；扩增长片段(≥5 kb)时，引物的长度建议为25 - 35 nt且Tm值应大于62℃。
Q2：使用P516/P526时，可以使用其他PCR酶的反应程序吗？
A2：不同PCR酶适宜的扩增程序不同；为得到理想扩增结果，使用P516/P526时建议使用P516/P526说明书中的反应程序。
Q3：P516/P526退火温度如何设置？
A3：①当上下游引物的Tm值均＞50℃，退火温度可使用60℃；②当上下游引物中的一条引物的Tm值≤50℃或两条引物的Tm均≤50℃，退火温度可使用50℃； ③也可按照引物自身Tm值设定退火温度。
Q4：P516/P526扩增速度是多少？
A4：对于单重扩增：长度<10 kb，建议使用15 s/kb； 长度≥10 kb，建议使用30 s/kb；对于多重扩增：建议使用30 s/kb（扩增长度建议< 2 kb）。过度扩增可能会出现拖带或非特异性扩增。
Q5：P516/P526多重扩增时，建议的循环数？
A5：进行多重扩增时，建议使用25个循环，循环数过多可能会影响扩增均一性。
Q6：扩增时产生突变的原因及建议？
A6：可以从以下几点来分析：
(1)模板本身存在突变
检查模板，若模板是质粒，建议送质粒去测序；若模板是cDNA，建议重复实验，如果仍有突变，可能是cDNA有问题，建议重新制备cDNA，制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。
(2) 模板长时间在紫外光下照射，引入突变
切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。
(3) 基因序列与NCBI上的不一致
建议再重复一次送去测序，若结果和上一次一样，说明序列可能和NCBI上的不一致。
(4) 少量序列存在非严谨序列
有相似重组序列，导致重组错位。
Q7：扩增效率低，实验组无扩增条带。
A7：(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解；引物设计是否合理，可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；模板为粗品，存在抑制物，建议降低模板浓度；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 酶
反应所用的酶失活，建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误，建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实际温度是否相符，如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活，温度过低则模板变性不彻底；退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度；检查延伸时间是否充足。
Q8：扩增的条带亮度不太亮。
A8：(1) 引物
检查人工合成的引物是否降解。
(2) 模板
首先确认模板的质量，长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；如果模板没有了，可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。
(3) 反应程序
可梯度摸索适宜退火温度；延长延伸时间，提高循环数。
Q9：扩增特异性差，非特异性扩增。
A9：(1) 引物
引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。
(2) 模板
模板不纯，被污染，需重新制备模板。
模板降解或过量，通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。
(3) 反应程序
反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
Q10：扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。
A10：(1) 胶
制胶时要使胶完全融化。
(2) 引物
检查引物是否降解。
(3) 模板
模板降解或过量，可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长，模板是cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度，逆转录时不加随机引物重新逆转录。
(4) 反应程序
反应程序不够优化。退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度。
Q11：空白对照出现扩增产物。
A11：(1) 引物设计不合理
扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致，说明有污染
更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染，可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
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