M&R HRP/DAB Detection IHC Kit
鼠兔通用型免疫组化（IHC）检测试剂盒
灵敏度高，特异性好，组化染色更出片儿！
免疫组化实验
鼠兔通用型免疫组化(IHC)检测试剂盒可用于以小鼠或兔的单克隆或多克隆抗体为一抗的免疫组化实验，检测原理基于山羊抗兔/小鼠标记聚合物与一抗结合生成免疫复合物，该聚合物能够催化DAB生成棕褐色沉淀。该试剂盒使用微聚合物技术将抗小鼠和抗兔二抗与辣根过氧化物酶聚合在一起，形成空间位阻明显较小的多聚物，提高了每个二抗偶联酶的分子数，在保留了聚合物系统紧密结构的同时，也保留了对一抗的高亲和力。该反应体系不仅能够有效地减少一抗的使用量，而且通过避免使用生物素，进一步排除了内源性生物素的干扰。
特异性好：非特异性染色少，背景更干净
灵敏度高：二抗信号放大作用强，DAB更灵敏，目的蛋白易检出
适用范围广：可用于冰冻、石蜡等多种样本类型，肿瘤、脑、肠、肝等多种组织
1、特异性好
使用 Anti-Akt (pan) Rabbit mAb对正常小鼠肝组织进行免疫组织化学分析。染色特异性与染色强度与Supplier A相当，背景特异性优于Supplier A。表明HC301具有较好的特异性。
2、灵敏度高
使用 Anti-phospho-Akt (Ser473) Rabbit mAb (Vazyme #RA2102) 对石蜡包埋的人乳腺癌组织进行免疫组织化学分析。使用Vazyme免疫组化试剂盒M&R HRP/DAB Detection IHC Kit #HC301，抗体1:100稀释；采用Supplier A免疫组化试剂盒，抗体1:25稀释。HC301在抗体浓度较低的情况下，仍能实现对目的蛋白的检出，且对比Supplier A试剂盒抗体高浓度情况下，HC301染色效果更好。
3、适用范围广
（1）冰冻切片
使用 TBC1D1 Polyclonal antibody对肌肉组织的冰冻切片进行免疫组织化学分析。HC301染色特异性优于Supplier A，其染色背景更干净，阴性对照组无明显背景染色。
（2）石蜡切片
a. 肠组织
使用 Anti-Erk1/2 Mouse mAb与p44/42 MAPK （Erk1/2）Rabbit mAb对正常小鼠肠组织进行免疫组织化学分析。
b. 心脏组织
使用 Anti-Akt (pan) Rabbit mAb对正常小鼠心脏组织进行免疫组织化学分析。
c. 脑组织
使用 p44/42 MAPK （Erk1/2）Rabbit mAb在进行抗体梯度稀释下对正常小鼠脑组织进行免疫组织化学分析。
d. 肿瘤组织
使用 Anti-phospho-Akt (Ser473) Rabbit mAb (Vazyme #RA2102) 对石蜡包埋人乳腺癌组织进行免疫组织化学分析。该组织进行抗原修复后对其进行λ磷酸酶去磷酸化处理，未经λ磷酸酶处理组可有效检验到组织内磷酸化水平，经λ磷酸酶处理后则无法检测到磷酸化目的蛋白。
使用 Anti-phospho-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) Rabbit mAb(Vazyme #RA2202) 对石蜡包埋的人乳腺癌组织进行免疫组织化学分析。
HC301适用范围广，可兼容冰冻切片、石蜡切片等样本类型，对多种组织中目的蛋白均能进行有效检测。
4、稳定性好
使用 p44/42 MAPK (Erk1/2) Rabbit mAb对正常小鼠脑组织进行免疫组织化学分析。HC301与Supplier A进行同种加压处理后，与Supplier A染色基本一致，相较于未加压对照组，性能无明显变化，表明HC301稳定性良好。
2 ~ 8℃保存，根据不同目的地调整运输方式。
Q1：染色结果呈阴性
A1：(1)抗体来源选择错误：本试剂盒二抗为抗兔/鼠，请确保一抗来源的种属为兔源或鼠源。
(2)组织切片本身不存在目的蛋白：可通过The Human Protein Atlas数据库或UniProt数据库查询目的蛋白在细胞或组织中的表达情况。
(3)抗体浓度和质量问题：提高抗体工作浓度或延长孵育时间；确认抗体可进行IHC实验，通过非IHC实验排除抗体质量问题。
(4)脱蜡不完全：可根据切片上是否存在透明颗粒，判断是否存在脱蜡不完全，若存在，需延长脱蜡时间或换用新的二甲苯。
(5)抗原修复不完全：对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；
(6)细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应：可加入组织透化步骤，进行细胞膜或核膜的透化。
(7)试剂盒保存不当：请于4℃进行保存，勿室温防止过长时间。
(8)封闭时间过长：若使用封闭液进行封闭，请排除封闭液对抗原抗体结合的影响。
Q2：染色弱
A2：(1)抗体浓度过低，孵育时间过短：可提高抗体浓度，进行抗体4℃过夜孵育。
(2)组织或细胞中目的抗原表达水平低：可延长DAB显色时间或延长二抗孵育时间。
(3)试剂超过有效使用期：及时更换试剂。
(4) 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释：可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）。
(5) 蛋白封闭过度：封闭时间不要超过2h。
Q3：高背景染色
A3：(1)一抗浓度过高：对抗体进行滴定以确定获得特异性反应的最佳浓度。
(2)显色过度：缩短显色试剂DAB孵育时间。
(3)洗涤不充分：适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间。
(4)封闭不完全：使用正常山羊血清或1~5%BSA封闭1h。
(5)离子相互作用造成的背景：降低抗体稀释液的离子强度。
(6)切片或细胞过于干燥或孵育温度过高：实验过程中请保持切片处于湿润状态，一抗孵育时尽量使用4℃过夜孵育。
(7)内源性过氧化物酶残余：适度延长内源性过氧化物酶阻断剂阻断时间。
(8)样本于缓冲液或抗原修复液中浸泡太久：样本在溶液中浸泡时间不要超过24h。
Q4：非特异性染色
A4：(1)抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加非特异性染色：由于本试剂盒使用Polymer二抗进行了反应的放大，该方法敏感性较高，可缩短抗体孵育时间或降低抗体浓度。
(2)内源性过氧化物酶残余：适度延长内源性过氧化物酶阻断剂阻断时间。
(3)一抗导致的非特异性染色：多克隆抗体易于产生非特异性染色，结合抗体官网信息合理选择多克隆抗体或单克隆抗体。
(4)一抗种属来源与组织样本来源相同：如使用鼠源一抗检测小鼠组织，尽量选择种属来源与样本种属不同的一抗。
(5)切片或细胞过于干燥：实验过程中，需保持样本的湿润。
Q5：阳性染色细胞定位不正确
A5：(1)抗原修复条件不合理：尝试改变抗原修复条件。
(2)固定方法不合理：可能由于不合理或不及时的固定导致抗原破坏，出现抗原弥散的现象，可尝试不同的固定剂或增加固定时间。
(3)离子相互作用影响抗原识别：尝试调整抗体稀释液的pH值或阳离子浓度。
Q6：切片边缘着色
A6：(1)样本边缘粘贴不牢，边缘松脱漂浮在液体中：增加清洗次数或延长清洗时间。
(2)试剂未完全覆盖样本：边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心高而致染色深。免疫组化笔画圈应距组织边缘大于3-4 mm，试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。
Q7：“阴阳脸”着色
A7：(1)即组织一半着色一般不着色：一般见于试剂分布不均匀或由于气泡导致的着色不均匀。试剂滴加后，应检查试剂是否分布均匀，可使用枪头将试剂引流开使之将组织全部覆盖。若滴加时易产生气泡，则滴加试剂时手法要轻，有气泡时用枪头捅破。
Q8：脱片
A8：(1)烤片时间不够，或温度不够：可以延长烤片时间和提高烤片温度。
(2)用含有多聚赖氨酸的玻片。
(3)组织差异：有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，进行清洗操作时洗涤液不要直接冲洗组织。
(4)使用高温修复时，温度骤冷：进行高温抗原修复时，需等待液体缓慢恢复至室温。
(5)冰冻切片未进行复温：冰冻切片应先于室温放置到复温后再浸泡至PBS中。
Q9：染色强度不均匀
A9：(1)切片厚度不均匀：切片的厚薄不一，可能导致染色呈现一边强，一边弱的情况。
(2)DAB染色液未混匀：DAB在样本上的浓度不一致，导致染色不均匀，加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。
(3)试剂未完全覆盖样本：边缘易由于未覆盖而导致无染色或弱染色。免疫组化笔画圈应距组织边缘大于3-4 mm，试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。
Q10：灶片状着色
A10：(1) 洗涤液的残留：洗涤液的残留可能导致其对后续试剂产生稀释作用，需尽量甩干样本残余洗涤液。
(2) 坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段可能与一抗或/和二抗结合影响最终着色，因此在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。
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