Phos-assay Acrylamide
无磷酸化抗体可用？快来解锁蛋白磷酸化检测新玩法！
蛋白磷酸化检测
分离效果好：可以分离出不同形式的磷酸化蛋白。
适用范围广：适用于纯化蛋白、细胞裂解液和体外激酶反应液等多种样本类型；
适用于Mn2+/Zn2+离子体系；
适用于无抗体可用的磷酸化蛋白检测；
适用于CBB染色、免疫印迹和质谱等多种下游实验。
组分齐全：有配套的金属离子。
操作简便：可同时检测磷酸化与非磷酸化，与常规SDS-PAGE操作程序几乎相同。
无放射性：不含放射性元素，非荧光物质。
稳定性好：溶液状态可在4℃避光条件下保存一年。
Phos-assay是一种能与磷酸分子特异性结合的双核金属络合物，用于分离和检测磷酸化蛋白。使用过程中只需在常规SDS-PAGE凝胶中添加Phos-assay和金属离子(Mn2+或Zn2+)即可。固定在凝胶上的Phos-assay复合物可以特异性结合磷酸化氨基酸，使得磷酸化蛋白电泳迁移率降低，从而实现磷酸化和非磷酸化蛋白的分离。Phos-assay SDS-PAGE操作简单，能检测不同形式的磷酸化蛋白，不受磷酸化抗体限制，可用于免疫印迹、质谱分析等。
1. 分离效果好
使用碱性磷酸酶以时间梯度和剂量梯度处理α-酪蛋白和β-酪蛋白，使用常规SDS-PAGE 和Phos-assay SDS-PAGE用CBB染色检测样品中磷酸化与非磷酸化蛋白的变化情况。
图1. 不同处理条件下纯化蛋白的CBB染色结果图
2. 适用范围广
除了纯化蛋白，Phos-assay SDS-PAGE还可以检测细胞裂解液、组织裂解液和激酶反应液等多种样本类型的磷酸化与非磷酸化蛋白表达。
图2. 不同样本磷酸化与非磷酸化蛋白检测结果图
（从左至右，样本类型依次为：细胞裂解液、激酶反应液、植物组织裂解液）
2 ~ 8℃避光保存
Q1：CBB染色的凝胶不能清楚地脱色？
A1:对于纯化蛋白CBB染色，电泳结束后，只需将(1.0 mm)凝胶浸泡在50 ml快染考马斯亮蓝染液浸泡15 min即可脱色，微波炉加热5 min，更换ddH2O，重复2 - 3次可以使条带更清晰。除了CBB染色外，凝胶也可用银染、荧光染色、阴性染色。
Q2：蛋白Marker条带弯曲，以及Marker是否依然具有原有的作用？
A2：一般预染Marker在Phos-assay凝胶中会产生弯曲条带，可以加入等体积的10 mM金属离子来改善这一现象，蛋白Marker仅可作为转膜效率的参考基准，无法推断蛋白分子量。
Q3：按照实验流程方法配制Mn2+-Phos-assay胶，剩余的分离胶溶液发黄是否正常？
A3：属于正常现象，Mn2+会在碱性条件下形成沉淀从而溶液变黄，配好分离胶溶液混匀及时灌胶，不影响凝胶Phos-assay性能。
Q4：除了使用此产品还需要什么试剂和仪器？
A4：只需要相应的金属离子，其余试剂和仪器和常规SDS-PAGE一致，电泳后续需要含有10 mMEDTA洗胶缓冲液预处理凝胶。
Q5：实验所需要的甲醇和金属离子需要什么纯度级别的试剂？
A5：市售分析纯即可。
Q6：可以检测哪些样品？
A6：样品可以为纯化蛋白、组织均浆液、组织裂解液、体外酶反应液，且样品来源无物种特异性。
Q7：每孔蛋白上样量需要多少？
A7：通常情况下，纯化蛋白上样量为5 - 10 μg，组织或细胞提取液上样量为15 - 30 μg，具体需要根据磷酸化蛋白表达进行调整。
Q8：配制好的Phos-assay凝胶可以存放使用吗？
A8：Mn2+-Phos-assay凝胶因在碱性缓冲液导致不稳定，建议现配现用，Zn2+-Phos-assay凝胶在中性缓冲液可以4℃保存3个月。
Q9：Phos-assay凝胶可以分离多大的蛋白？
A9：根据文献报道和客户实验反馈，可分离4 - 350 kDa大小的蛋白。
Q10：体外激酶实验存在ATP，对Phos-assay实验有无影响？
A10：ATP使用浓度在2.0 mM时，对实验结果无显著影响，具体使用范围尚不清楚。
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