FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2
6 min细胞/动物组织RNA轻松提取！
动物组织/细胞总RNA提取；产物可用于RT-PCR；Real-Time PCR；芯片分析
- 快速：常温操作6min即可
- 安全无毒：无需β-巯基乙醇、酚氯仿等有毒害试剂
- 基因组残留少：无需DNase I膜上消化，一步去除gDNA污染
- 通用性强：兼容各种细胞、组织样本
1.快速
6min即可完成动物组织、细胞RNA提取（图中标注时间为裂解及离心时间）。
2.RNA产量高、纯度高
分别使用Vazyme #RC112 (上图简称：V)与市售相关产品，按照各自说明书提取大鼠肝脏组织(10 mg) 、293细胞样本的总RNA。分别对RNA产物进行浓度和纯度检测，从图中可以看出Vazyme #RC112提取不同样本的总RNA与市售其他产品相比，产量更高。OD260/280及OD260/230数值更接近标准数值，纯度更好。
3.通用性强
使用Vazyme #RC112 对以下9 种样本（人293 细胞、Hela细胞，大鼠：肝、脾、肺、肾、心、脑组织，小鼠：脂肪组织）进行RNA 提取纯化，并对最终获得的RNA 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出Vazyme #RC112 能很好地兼容不同的细胞和动物组织样本RNA 的提取。
本试盒基于硅胶柱纯化技术，仅需6 min即可从动物组织、细胞中提取高质量的总RNA。试剂盒无需使用有毒的酚/氯仿以及β-巯基乙醇，并可有效去除杂质和gDNA。得到的总RNA纯度高，gDNA残留少,无蛋白和其他杂质污染。
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组分 |
RC112-01（50 rxn） |
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Buffer RL |
35 ml |
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Buffer RW1 |
45 ml |
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Buffer RW2 |
20 ml |
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RNase-free ddH2O |
10 ml |
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FastPure gDNA-Filter Columns Ⅲ (each in a 2 ml Collection Tube) |
50个 |
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FastPure RNA Columns Ⅲ (each in a 2 ml Collection Tube) |
50个 |
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RNase-free Collection Tubes 1.5 ml |
50个 |
15 ~ 25℃储存，室温运输 。
Q1：提取RNA出现降解
A1：（1）组织样本采集与保存不当：
1. RNA 提取时要选新鲜组织或细胞样本，避免反复冻融。样品离开活体或原来的生长环境后，样品中的内源性RNase 开始降解RNA，降解速度与内源RNase 的含量及温度有关；
2. 组织离体后须迅速放入液氮中速冻，后期再转移至-80℃长期保存；
3. 或者可将新鲜动物组织充分浸泡在RNA Keeper Tissue Stabilizer (Vazyme #R501)中，在室温可存放一周，2 ~ 8℃ 存放一个月，或在-30 ~ -15℃/-85 ~ -65℃ 长期保存；
（2）提取操作：
1. 样本破碎过程中出现问题：
a. 若细胞或组织样品未冻存（如新鲜样本/浸润Vazyme #R501中样本）需立即加入裂解液中，并迅速进行匀浆裂解，注意匀浆过程中温度不能过高；
b. 若为冻存组织，需进行液氮研磨，在整个研磨过程中，样品不得融化；
2. 样本投入量：
样本投入量过多，裂解液中的裂解剂以及RNase抑制剂不能完全作用于所有的样本；且裂解不充分，导致RNase发挥作用造成内源性RNase的降解；
3. 无RNase操作：
确保提取RNA的试剂和器具没有被RNase 污染，所有离心管、枪头及相关溶液都必须无RNase 污染，耐高温器物可于150℃ 烘烤4 - 6 h以去除RNase，其它器物可用0.1% 的DEPC 水浸泡过夜以去除RNase；做好防护工作，戴口罩和一次性干净手套，并在单独的洁净区操作；
（3）RNA 保存、电泳：
1. 保存：对提取的RNA 进行纯度和完整度检测，分管在-80℃长期保存或在-20℃ 短期保存，尽快使用，避免反复冻融；
2. 电泳：电泳前将电泳槽用3%双氧水浸泡20min，然后用RNase-free ddH2O进行冲洗，电泳缓冲液用RNase-free ddH2O进行配置，进行电泳检测可以提高电压并缩短跑胶时间，同时对电泳缓冲液进行冰浴降温，防止跑胶过程中RNA发生降解。
Q2：提取不到RNA 或者RNA 产量低
A2：（1）样本采集与保存：
1. 事先了解好提取样本中RNA含量水平，确保投入量达到要求起始值；
2. 样本保存不当或者保存时间过长都有可能导致RNA 的降解，采集新鲜样本或经过液氮速冻后保存于-70℃ 或液氮中的样本；
（2）样本前处理及裂解：匀浆或者液氮研磨不充分，裂解不充分，导致RNA 的释放不充分；
（3）提取纯化：
1. 柱式法：RNase-free ddH2O 滴加到纯化柱膜中央，尽可能覆盖整个吸附膜；纯化柱的洗脱体积为50-200 μl，若洗脱效果不理想，可以加入在55-70℃ 预热的RNase-free ddH2O 后，延长室温放置时间，离心后进行第二次洗脱；
Q3：提取的RNA 有基因组DNA 污染
A3：①减少样本起始投入量；
①使用DNase I 进行膜上消化清除DNA 污染；
③逆转录时选择含有基因组去除模块的逆转录试剂，推荐使用R323/R223；
④设计引物时选用跨内含子的引物，从而避免基因组DNA 模板参与扩增反应；
Q4：提取的RNA纯度低
A4：（1）蛋白质污染：
采用分光光度计检测提取产物OD260/OD280 偏低时，提示可能存在蛋白质污染：需要考虑是否组织投入量过大，导致裂解不充分，可以适当增加裂解液或者降低组织投入量进行提取；对于一些比较复杂、含有较多杂质的样本需进行特殊处理；
（2）盐离子及多糖污染：
采用分光光度计检测提取产物OD260/OD230偏低时，提示可能存在多糖及盐离子残留，需要考虑是否是因为乙醇未去除干净或者是组织投入量过大导致：
- 在提取中75%乙醇洗涤后室温放置5 min 再进行离心操作，以最大程度上去除盐离子污染；
- 洗脱后RNA中有盐离子残留：
纯化柱需要进行两次漂洗液2 洗涤，如果两次洗涤后还存在盐离子残留，则在加入漂洗液2后，室温放置5 min 再进行离心操作，以最大程度上去除盐离子污染；
- 洗脱后RNA有乙醇残留：
确认漂洗液2 洗涤后，按操作说明所需的离心转速进行空管离心操作；如果仍乙醇残留，可在空管离心后在室温放置 5 min，最大程度上去除残留乙醇；
（3）脂肪污染：
处理脂肪含量丰富的组织时，加入裂解液离心之后，上层是大量脂肪，可以转移澄清中间层进行下一步操作。
Q5：纯化柱出现堵塞问题
A5：（1）样品用量太多：
RC112适用于提取10 - 20 mg动物组织或者＜5×106个培养细胞，超量的组织会降低产量以及纯度，操作时应减少样本使用量；
（2）样品富含肌纤维：
肌肉、心脏以及皮肤等富含肌纤维，肌纤维的分子量大，会引起柱子堵塞，样本处理时采用液氮研磨方式会降低堵柱现象；
（3）组织研磨或者匀浆不充分：
研磨或者匀浆不充分时，碎片有可能导致柱堵塞，将裂解后的液体先进行13,000×g 离心5 min，取上清再加入gDNA-Filter Columns；
（4）样本裂解不充分：
减少投入量；增加裂解液的体积；充分震荡，直至样本无明显团块；
（5）消化液中存在不溶解的物质：
若样品消化后仍存在明显的颗粒，于12,000 g 离心3 min 去除未消化的物质。
Q6：RC112和RC101提细胞样本（如293细胞、Hela细胞）或者组织样本效果有什么差别吗
A6：研发端测试RC112和RC101提细胞样本（如293细胞、Hela细胞）的rna效果基本一致。RC112更快速，RC101兼容范围广。
Q7：RC112试剂盒中的RNA吸附柱最大结合能力是多少
A7：RNA吸附柱最大结合能力200μg。
Q8：RC112与RC101区别是什么
A8：RC101配有DNase膜上消化模块，无需单独购买；RC112无需DNase膜上消化，一步去除gDNA；
RC101产量高；RC112速度快，常温只需6min；
RC112安全无毒，无需β巯基乙醇。
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