Phanta Flash Super-Fidelity DNA Polymerase
快速扩增与保真度“兼具”的高保真单酶
分子克隆；基因鉴定；基因合成
Phanta Flash Super-Fidelity DNA Polymerase是一款“兼具”快速扩增和保真度的高保真单酶，延伸速度5 sec/kb，保真度是Taq酶的106倍。应用了新一代热启动技术，配以合适的buffer及特异因子，扩增特异性和成功率显著提高。本款产品对常规模板、粗品模板（细菌、酵母、动植物裂解产物、全血样本等）、高GC/AT模板、 含尿嘧啶模板、含PCR抑制物模板（腐殖酸、乙醇、胆酸盐、血红素等）均可兼容。2 x Phanta Flash Buffer中已经预混了dNTPs与镁离子，相比于一般单酶，简化了加样步骤，操作更加简便省时。
快速扩增：1 h即可完成10 kb以内片段的扩增（≤10 kb，延伸速度5 sec/kb；＞10 kb，延伸速度10 sec/kb）。
保真度高：保真度为Taq酶的106倍。
高成功率：轻松扩出目的条带
适应性广：可兼容粗品模板、高GC/AT模板 (整体GC 24%-79%，局部GC 22%-88%)、甲基化模板、含PCR抑制物模板。
操作简便：“单酶 + buffer”，加样更简单。
1.快速扩增
使用Phanta Flash Super-Fidelity DNA Polymerase （Vazyme #P521，简称P521）以及市售其他高保真单酶（Supplier A、B-1、B-2、C和D），按照各自说明书推荐的反应体系及反应程序扩增相同模板，结果显示，P521以5 sec/kb的延伸速度，可以成功扩增7,311 bp的cDNA和7,476 bp的基因组DNA，扩增速度和成功率均较优。
图 1a 扩增10 kb片段所需的扩增时间对比
图 1b 5 sec/kb的延伸速度可成功扩增7,311 bp的cDNA及7,476 bp的基因组DNA
2.保真度高
采用二代测序方法（P. Mielinis. et al. Journal of Molecular Biology (2021)），测定不同聚合酶的扩增保真度。结果显示，Phanta Flash Super-Fidelity DNA Polymerase保真度是Taq DNA Polymerase的106倍。
图 2 不同品牌高保真酶保真度比对
3.适应性广
使用Phanta Flash Super-Fidelity DNA Polymerase （Vazyme #P521，简称P521）以及市售其他高保真单酶（Supplier A、B-1、B-2、C和D），扩增粗品模板及高GC/AT模板，P521均可成功扩增。
图 3a 粗品模板扩增体系
图 3b 高GC/AT模板扩增体系
-30~-15℃保存，≤0℃运输
Q1：扩增效率低，实验组无扩增条带。
A1：(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解；引物设计是否合理，可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开，此时加入PCR Enhancer（Vazyme #P021），可以有效降低解链温度；模板为粗品，存在抑制物，建议降低模板浓度（稀释使用；若样本为植物叶片，要确保植物为非多糖多酚植物，取新鲜幼嫩的叶片，并将叶片面积剪小，如黄枪头尖部面积大小）；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 酶
反应所用的酶失活，建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误，建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实际温度是否相符，如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活，温度过低则模板变性不彻底；退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度；检查延伸时间是否充足。
Q2：扩增的条带亮度不太亮。
A2：(1) 引物
检查人工合成的引物是否降解。
(2) 模板
首先确认模板的质量，长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；如果模板没有了，可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。
(3) 反应程序
可梯度摸索最适宜退火温度；延长延伸时间，提高循环数。
Q3：扩增特异性差，非特异性扩增。
A3：(1) 引物
引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。
(2) 模板
模板不纯，被污染，需重新制备模板。
模板降解或过量，通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。
(3) 反应程序
反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
Q4：扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。
A4：(1) 胶
制胶时要使胶完全融化。
(2) 引物
检查引物是否降解。
(3) 模板
模板降解或过量，可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长，模板是cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度，逆转录时不加随机引物重新逆转录。
(4) 反应程序
反应程序不够优化。退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度。
Q5：空白对照出现扩增产物。
A5：(1) 引物设计不合理
扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致，说明有污染
更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染，可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
Q6：高保真酶扩增存在突变。
A6：高保真酶在PCR时扩增产物有突变，可以从以下几点来分析：
(1) 模板本身存在突变
检查模板，若模板是质粒，建议送质粒去测序；若模板是cDNA，建议重复实验，如果仍有突变，可能是cDNA有问题，建议重新制备cDNA，制备cDNA前检测RNA的完整度及纯度。
(2) 模板长时间在紫外光下照射，引入突变
切胶回收过程中避免长时间在紫外光下照射。
(3) 基因序列与NCBI上的不一致
建议再重复一次送去测序，若结果和上一次一样，说明序列可能和NCBI上的不一致。
(4) 少量序列存在非严谨序列
有相似重组序列，导致重组错位。
Q7：逆转录后的产物cDNA作为模板，使用高保真酶，一次应该加多少体积？
A7：说明书建议cDNA模板使用量为1-5 μl（不超过PCR反应总体积的1/10），可在这个范围内尝试不同的使用量，摸索合适使用量。
Q8：细胞作为模板，使用高保真酶，模板投入量应该加多少？
A8：经测试，模板投入量建议投入10的3次方个细胞，模板投入量过多会抑制PCR反应。
Q9：高保真酶扩增产物是否带A尾，如何加A尾
A9：高保真酶扩增产物不带A，后续做克隆可尝试使用Vazyme拓扑克隆产品C603；若进行TA克隆可用普通的Taq酶进行加A尾。
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