2 × KeyPo SE Master Mix(Dye Plus)
高成功率与快速扩增“兼具”的高保真酶预混液
基因鉴定、复杂体系、高通量建库
2 × KeyPo SE Master Mix(Dye Plus)是基于BioSmart平台定向筛选开发的兼具扩增成功率高和快速扩增(15 sec/kb）的高保真酶预混液。新一代热启动技术和高度适配的缓冲体系使其可在40 kb以内进行高特异的单重PCR，在300 bp - 15 kb内进行高度均一性的多重PCR，将GC偏好性降至较低程度。适用于常规模板、超长片段、高GC/高AT体系、含尿嘧啶模板、动植物裂解产物及细胞/全血/叶片直扩。只需加入模板和引物即可进行扩增，使用方便；含电泳指示剂，PCR反应完即可直接点样电泳。
超长扩增： gDNA≤40 kb 、质粒≤30 kb、 λDNA≤17.8 kb、 cDNA≤15 kb
多重扩增：兼容300 bp-15 kb的12重扩增
高成功率：复杂体系轻松扩增（高GC/高AT、裂解产物、菌斑/菌液、全血/细胞/叶片直扩等）
简单快速：扩增速度15-30 sec/kb，PCR反应完即可直接点样电泳
1.超长扩增
使用2 × KeyPo SE Master Mix(Dye Plus)（Vazyme #PK512，简称PK512）及市售其他高保真酶（Supplier A），按照各自说明书推荐体系和程序扩增不同长度模板。结果显示：PK512可成功扩增40 kb的gDNA、30 kb的质粒、17.8 kb 的λDNA、15 kb的cDNA；PK512扩增长度优于Supplier A。
2.多重扩增
使用PK512及市售其他高保真酶（Supplier A、Supplier B），按照各自说明书推荐体系和程序扩增不同重数的体系。结果显示：PK512在300 bp - 15 kb内可进行高度均一性的12重PCR；PK512扩增重数优于Supplier A、Supplier B。
3.高成功率
（1）扩增程序
使用PK512及市售其他高保真酶（Supplier A），测试扩增程序兼容性。结果显示：PK512引物Tm值兼容性广，上游引物（F）Tm值为64℃、下游引物（R）Tm值为69℃时，退火温度使用55-72℃均可成功扩增；PK512可在一台PCR仪中同时成功扩增11个不同长度/不同Tm值的片段；PK512扩增产量优于Supplier A。
（2）模板类型
使用PK512及市售其他高保真酶（Supplier A），测试不同模板类型兼容性。结果显示：PK512可兼容高GC/高AT体系、磁珠法/柱式法/醇沉法提取的gDNA、动植物裂解产物、菌斑/菌液、细胞/全血/叶片直扩、亚硫酸盐处理gDNA/含dUTP碱基；PK512扩增成功率、特异性、产量优于Supplier A。
-30~-15℃保存，≤0℃运输
Q1：PK512以cDNA为模板扩增时，cDNA推荐投入量？
A1：cDNA投入量建议不超过总反应体系的1/10。若使用Vazyme #R312/R212逆转（RNA投入量1 μg），建议50μl体系投入1-2μl原液即可。若使用Vazyme #R412逆转（RNA投入量1 μg），建议50μl体系投入1μl原液即可，投入过多可能会出现PCR产物黏稠和电泳堵胶孔。
Q2：PK512可兼容的模板类型？
A2：常规模板（gDNA、cDNA、质粒），含尿嘧啶模板（甲基化DNA、扩增时加入dUTP），高GC/高AT模板（GC含量整体24%-79%，局部22%-100%）、动植物裂解产物、菌液/菌斑、全血/细胞/叶片直扩等。
注：细胞直扩参考方法：取500 μl细胞悬浊液，离心（≤5000 rpm，4-5 min），弃上清；加入1 ml PBS，用移液枪吹打混匀，离心，弃上清，重复清洗4-5次；然后用水稀释到适合的细胞浓度使用，建议20 μl体系投入104-6个细胞。
叶片直扩参考方法：将叶片，直接剪2-4 mm2，投入50 μl反应体系中，涡旋混匀后进行PCR
Q3：PK512是否可以扩增酵母？是否可以扩增含U碱基引物？
A3：Vazyme #PK512-C3（扩增速度1 min/kb）更适宜扩增酵母菌斑/菌液及含U碱基引物；PK512常规货号（PK512-01/02/03）因速度快（15-30 sec/kb），对于上述两类样本，个别体系可能扩增不稳定。
Q4：扩增效率低，实验组无扩增条带。
A4：(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解；引物设计是否合理，可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；模板为粗品，存在抑制物，建议降低模板浓度；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 酶
反应所用的酶失活，建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误，建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实际温度是否相符，如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活，温度过低则模板变性不彻底；退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度；检查延伸时间是否充足。
Q5：扩增的条带亮度不太亮。
A5：(1) 引物
检查人工合成的引物是否降解。
(2) 模板
首先确认模板的质量，长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；如果模板没有了，可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。
(3) 反应程序
可梯度摸索适宜退火温度；延长延伸时间，提高循环数。
Q6：扩增特异性差，非特异性扩增。
A6：(1) 引物
引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。
(2) 模板
模板不纯，被污染，需重新制备模板。
模板降解或过量，通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。
(3) 反应程序
反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
Q7：扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。
A7：(1) 胶
制胶时要使胶完全融化。
(2) 引物
检查引物是否降解。
(3) 模板
模板降解或过量，可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长，模板是cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度，逆转录时不加随机引物重新逆转录。
(4) 反应程序
反应程序不够优化。退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索合适的退火温度。
Q8：空白对照出现扩增产物。
A8：(1) 引物设计不合理
扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致，说明有污染
更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染，可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
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